番茄紅素是萜類化合物中的一種,廣泛運用于制藥、營養(yǎng)、化妝品和食品等行業(yè)。利用大腸桿菌生產(chǎn)番茄紅素具有產(chǎn)量高、易于放大等特點,受到了廣泛的關(guān)注。但是目前以葡萄糖為原料合成番茄紅素的過程中存在理論轉(zhuǎn)化率低、生產(chǎn)成本高、難以提高產(chǎn)量等問題。因此,尋找可替代葡萄糖的廉價碳源是有效的方式之一。本研究選擇棕櫚酸作為合成番茄紅素的碳源,其優(yōu)勢體現(xiàn)在棕櫚酸可以通過β-氧化產(chǎn)生乙酰輔酶A,而乙酰輔酶A是甲羥戊酸(MVA)途徑的唯一前體,MVA途徑的是提高番茄紅素生產(chǎn)的常用途徑。因此棕櫚酸可作為生產(chǎn)番茄紅素的碳源,為MVA途徑提供充足的前體和能量。本實驗的目的是構(gòu)建一個可以利用棕櫚酸為原料合成番茄紅素的工程菌株。通過簡化菌株體系和優(yōu)化代謝途徑,最終獲得一個高產(chǎn)且穩(wěn)定的產(chǎn)番茄紅素的菌株。本研究首先將棕櫚酸代謝模塊和產(chǎn)番茄紅素模塊結(jié)合,驗證棕櫚酸可以作為唯一碳源生產(chǎn)番茄紅素。在實驗室前期已經(jīng)構(gòu)建了兩株可以利用棕櫚酸的菌株FA01和FA02,在此基礎(chǔ)上通過細(xì)胞轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入三個攜帶番茄紅素途徑基因的質(zhì)粒:pLESKs、pSKPMIc和pLY116。通過檢測菌株利用棕櫚酸合成番茄紅素的產(chǎn)量,發(fā)現(xiàn)有番茄紅素的單一色素生...

【文章頁數(shù)】：85 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1.文獻(xiàn)綜述
    1.1 番茄紅素
        1.1.1 番茄紅素的結(jié)構(gòu)
        1.1.2 番茄紅素的功能
        1.1.3 番茄紅素的合成
        1.1.4 番茄紅素的生物合成
        1.1.5 番茄紅素的生物合成途徑(MVA和MEP)
    1.2 脂肪酸
        1.2.1 脂肪酸的種類
        1.2.2 脂肪酸的代謝概述
        1.2.3 脂肪酸降解途徑的調(diào)節(jié)
    1.3 棕櫚酸為作為替代碳源生產(chǎn)番茄紅素
        1.3.1 棕櫚酸與MVA途徑的聯(lián)系
        1.3.2 能量與物質(zhì)代謝比較
        1.3.3 棕櫚酸作為理想的替代碳源
    1.4 番茄紅素的生物合成途徑的改造
        1.4.1 番茄紅素的生物合成途徑常用改造方法
        1.4.2 基因編輯優(yōu)化MVA途徑的現(xiàn)狀
        1.4.3 基因整合方法優(yōu)化代謝途徑的局限
        1.4.4 新的位點特異性重組方法的建立-NRMI(Nigrirecombinasemediatedintegration)的整合方法
    1.5 研究目的和意義
2.棕櫚酸利用模塊和番茄紅素合成模塊的結(jié)合
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 菌株和質(zhì)粒
        2.2.2 實驗儀器
        2.2.3 實驗試劑
        2.2.4 主要溶液
    2.3 方法
        2.3.1 檢測棕櫚酸消耗的方法
        2.3.2 棕櫚酸利菌株產(chǎn)番茄紅素的工程菌株的構(gòu)建
        2.3.3 檢測棕櫚酸利用菌株產(chǎn)番茄紅素的能力
    2.4 結(jié)果
        2.4.1 棕櫚酸利用菌株利用棕櫚酸的能力。
        2.4.2 棕櫚酸利用菌株產(chǎn)番茄紅素的能力
    2.5 討論
    2.6 小結(jié)
3.新的位點特異性重組方法-NRMI(Nigrirecombinasemediatedintegration)
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 菌株和質(zhì)粒
        3.2.2 實驗儀器
        3.2.3 實驗試劑
        3.2.4 主要溶液
    3.3 方法
        3.3.1 質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.2 Crispr-Cas9方法構(gòu)建BW-nox、BW-lox66和BW-rox菌株
        3.3.3 BW-PIR菌株的構(gòu)建
        3.3.4 Nigri的介導(dǎo)下質(zhì)粒整合的方法
    3.4 結(jié)果
        3.4.1 Nigri整合方法的驗證
        3.4.2 消除nox位點實現(xiàn)連續(xù)整合
        3.4.3 利用NRMI整合方法建立大片段基因連續(xù)的策略
    3.5 討論
    3.6 小結(jié)
4.MVA途徑的優(yōu)化
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 菌株和質(zhì)粒
        4.2.2 實驗儀器
        4.2.3 實驗試劑
        4.2.4 主要溶液
    4.3 方法
        4.3.1 菌株的構(gòu)建
        4.3.2 PM模塊的整合方法
        4.3.3 ESK模塊的整合方法
    4.4 利用NRMI方法優(yōu)化MVA途徑
        4.4.1 MVA途徑的優(yōu)化-PM模塊整合至染色體
        4.4.2 MVA途徑的優(yōu)化-ESK模塊整合至染色體
    4.5 討論
    4.6 小結(jié)
結(jié)論
展望
參考文獻(xiàn)
附錄A pLESKs、pSKPMIc和pLY116質(zhì)粒圖譜
附錄B NRMI方法中的位點和基因序列
附錄C pW-Nigri、pW-Cre和pW-Dre三個質(zhì)粒圖譜
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況
致謝



本文編號：3897877