熒光染料特異性結合核糖核酸(RNA)適配體發(fā)光作為生物傳感的新方法,是近年來分析化學和生命科學交叉領域的一個重要突破。人們把這種發(fā)光的核糖核酸-染料復合物,稱之為“點亮”探針。此類探針不僅僅可用于體外目標物的檢測,比如環(huán)境中的重金屬、細胞提取物中的代謝小分子、重要的功能蛋白,它還可作為一個類似綠色熒光蛋白(GFP)的“標簽”分子,被廣泛應用于活細胞熒光成像,對細胞內目標RNA分子進行示蹤、動力學研究及細胞成分的定量研究,這類“標簽”分子主要以“Spinach”(菠菜)為代表。除此之外,還有黃酰羅丹明B-適配體復合物,作為生物傳感器點亮探針應用在原核生物中,連有二硝基氟苯的黃酰羅丹明B共軛物在沒有結合適配體的時候,處于熒光猝滅的狀態(tài),當與適配體結合后,由于空間構象變化,使熒光團與猝滅基團分開,從而導致熒光團重新恢復熒光。點亮核糖核酸適配體,不僅可以通過體外合成方法得到,還可以通過基因工程在活細胞內編碼而成。它主要是利用宿主細胞本身的遺傳調控機制,將人為設計拼接好的標準化基因模塊表達出來,產物不僅僅是RNA適配體序列,也可以是蛋白分子。通過構建各種不同的質粒載體,在活細胞中表達出RNA適配...

【文章頁數】：149 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 核酸適配體概述
    1.2 熒光團-核糖核酸適配體“點亮”型生物傳感器
        1.2.1 點亮核糖核酸適配體篩選
        1.2.2 點亮核糖核酸適配體選擇激活的染料熒光團種類
        1.2.3 工作原理
        1.2.4 熒光團-核糖核酸適配體生物傳感器用于體外檢測的應用
        1.2.5 熒光團-核糖核酸適配體傳感器用于細胞內成像應用
    1.3 基于“點亮”型熒光團-核糖核酸傳感器在CRISPR技術中應用
        1.3.1 II型CRISPR簡介
        1.3.2 點亮RNA適配體-熒光團的應用
    1.4 本論文研究的構想
第2章 體外轉錄RNA適配體生物傳感器免標記多重檢測miRNA分子
    2.1 前言
    2.2 實驗部分
        2.2.1 試劑與儀器
        2.2.2 DNA-RNA雜交形成Splint連接反應體系
        2.2.3 T7核糖核酸聚合酶體外轉錄
        2.2.4 瓊脂糖凝膠電泳分析
        2.2.5 核糖核酸適體傳感器檢測miRNA的熒光測定
        2.2.6 細胞培養(yǎng)及樣品制備
        2.2.7 RT-PCR定量檢測不同細胞內miRNA21及miRNA141表達水平
    2.3 結果與討論
        2.3.1 實驗設計原理
        2.3.2 分析方法體外響應驗證
        2.3.3 凝膠電泳分析
        2.3.4 傳感器對不同濃度目標物的光譜曲線的測定
        2.3.5 分析方法的選擇性研究
        2.3.6 適體傳感器對細胞中總microRNA的測定
    2.4 小結
第3章 基于“鄰近效應”體外轉錄產生適配體生物傳感器檢測前列腺特異性抗原分子
    3.1 前言
    3.2 實驗部分
        3.2.1 試劑與儀器
        3.2.2 抗體標記的DNA探針的制備
        3.2.3 PSA鄰近連接反應體系
        3.2.4 體外轉錄RNA適配體
        3.2.5 熒光測定
        3.2.6 瓊脂糖凝膠電泳分析
        3.2.7 ELISA檢測
        3.2.8 熒光定量PCR檢測
    3.3 結果與討論
        3.3.1 實驗設計原理
        3.3.2 探針制備
        3.3.3 分析方法的體外驗證
        3.3.4 實驗條件的優(yōu)化
        3.3.5 生物傳感器檢測PSA
        3.3.6 傳感器特異性研究
        3.3.7 血液中PSA的測定
    3.4 小結
第4章 遺傳編碼RNA適配體生物傳感器用于活細胞內miR分子的比率型成像研究
    4.1 前言
    4.2 實驗部分
        4.2.1 試劑與儀器
        4.2.2 黃酰羅丹明B-(PEG)3-二硝基氟苯共軛物的合成
        4.2.3 質粒構建
        4.2.4 RNA適體傳感器的體外轉錄
        4.2.5 RNA適體傳感器的體外分析
        4.2.6 瓊脂糖凝膠電泳分析
        4.2.7 細胞培養(yǎng)和轉染
        4.2.8 細胞成像
        4.2.9 熒光定量PCR檢測RNA適體
        4.2.10 熒光定量PCR檢測miRNA
    4.3 結果與討論
        4.3.1 實驗設計原理
        4.3.2 黃酰羅丹B-二硝基氟苯(SR-DN)共軛物的合成與其在細胞中滲透性研究
        4.3.3 適體生物傳感器的體外優(yōu)化與合成
        4.3.4 適體生物傳感器的體外響應實驗
        4.3.5 質粒轉染細胞成像
        4.3.6 實時定量PCR分析細胞內生物傳感器的表達水平
        4.3.7 質粒構建與表征
        4.3.8 細胞共聚焦成像
    4.4 小結
第5章 單啟動子驅動魯棒比率型內標和RNA適配體生物傳感器用于活細胞內mRNA分子的定量分析
    5.1 前言
    5.2 實驗部分
        5.2.1 試劑與儀器
        5.2.2 質粒構建
        5.2.3 RNA適體傳感器的體外轉錄
        5.2.4 RNA適體傳感器的體外分析
        5.2.5 瓊脂糖凝膠電泳分析
        5.2.6 細胞培養(yǎng)和轉染
        5.2.7 細胞成像
        5.2.8 熒光定量PCR檢測GFP和適配體RNA
        5.2.9 RNA標準曲線的建立
        5.2.10 mRNA絕對定量檢測
    5.3 結果與討論
        5.3.1 實驗設計原理
        5.3.2 質粒構建示意圖
        5.3.3 質粒構建與表征
        5.3.4 帶有魯棒內標的核酸適體質粒轉染后細胞成像
        5.3.5 實時定量PCR檢測RNA元件的表達
        5.3.6 適體傳感器的體外響應實驗
        5.3.7 傳感器的體內響應實驗
        5.3.8 細胞內mRNA拷貝數標準曲線的建立
        5.3.9 ROI熒光標準曲線的建立
        5.3.10 不同細胞系mRNA定量研究
    5.4 小結
第6章 基于CRISPR體系轉錄激活點亮RNA適配體用于活細胞內mRNA分子成像研究
    6.1 前言
    6.2 實驗部分
        6.2.1 實驗試劑
        6.2.2 體外轉錄gRNA
        6.2.3 DNA體外切割實驗
        6.2.4 瓊脂糖凝膠電泳分析
        6.2.5 質粒構建
        6.2.6 細胞培養(yǎng)和轉染
        6.2.7 細胞成像
        6.2.8 RT-PCR檢測細胞內適配體的表達
        6.2.9 RT-PCR檢測細胞內mRNA的表達
    6.3 結果與討論
        6.3.1 工作原理
        6.3.2 質粒表征
        6.3.3 質粒DNA體外酶切驗證
        6.3.4 細胞內RNA分子激活成像
        6.3.5 藥物處理后細胞成像及RT-PCR
    6.4 小結
結論
參考文獻
附錄A 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄
致謝



本文編號：3771643