熒光染料特異性結(jié)合核糖核酸(RNA)適配體發(fā)光作為生物傳感的新方法,是近年來(lái)分析化學(xué)和生命科學(xué)交叉領(lǐng)域的一個(gè)重要突破。人們把這種發(fā)光的核糖核酸-染料復(fù)合物,稱之為“點(diǎn)亮”探針。此類探針不僅僅可用于體外目標(biāo)物的檢測(cè),比如環(huán)境中的重金屬、細(xì)胞提取物中的代謝小分子、重要的功能蛋白,它還可作為一個(gè)類似綠色熒光蛋白(GFP)的“標(biāo)簽”分子,被廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞熒光成像,對(duì)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)RNA分子進(jìn)行示蹤、動(dòng)力學(xué)研究及細(xì)胞成分的定量研究,這類“標(biāo)簽”分子主要以“Spinach”(菠菜)為代表。除此之外,還有黃酰羅丹明B-適配體復(fù)合物,作為生物傳感器點(diǎn)亮探針應(yīng)用在原核生物中,連有二硝基氟苯的黃酰羅丹明B共軛物在沒(méi)有結(jié)合適配體的時(shí)候,處于熒光猝滅的狀態(tài),當(dāng)與適配體結(jié)合后,由于空間構(gòu)象變化,使熒光團(tuán)與猝滅基團(tuán)分開(kāi),從而導(dǎo)致熒光團(tuán)重新恢復(fù)熒光。點(diǎn)亮核糖核酸適配體,不僅可以通過(guò)體外合成方法得到,還可以通過(guò)基因工程在活細(xì)胞內(nèi)編碼而成。它主要是利用宿主細(xì)胞本身的遺傳調(diào)控機(jī)制,將人為設(shè)計(jì)拼接好的標(biāo)準(zhǔn)化基因模塊表達(dá)出來(lái),產(chǎn)物不僅僅是RNA適配體序列,也可以是蛋白分子。通過(guò)構(gòu)建各種不同的質(zhì)粒載體,在活細(xì)胞中表達(dá)出RNA適配...

【文章頁(yè)數(shù)】：149 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 核酸適配體概述
    1.2 熒光團(tuán)-核糖核酸適配體“點(diǎn)亮”型生物傳感器
        1.2.1 點(diǎn)亮核糖核酸適配體篩選
        1.2.2 點(diǎn)亮核糖核酸適配體選擇激活的染料熒光團(tuán)種類
        1.2.3 工作原理
        1.2.4 熒光團(tuán)-核糖核酸適配體生物傳感器用于體外檢測(cè)的應(yīng)用
        1.2.5 熒光團(tuán)-核糖核酸適配體傳感器用于細(xì)胞內(nèi)成像應(yīng)用
    1.3 基于“點(diǎn)亮”型熒光團(tuán)-核糖核酸傳感器在CRISPR技術(shù)中應(yīng)用
        1.3.1 II型CRISPR簡(jiǎn)介
        1.3.2 點(diǎn)亮RNA適配體-熒光團(tuán)的應(yīng)用
    1.4 本論文研究的構(gòu)想
第2章 體外轉(zhuǎn)錄RNA適配體生物傳感器免標(biāo)記多重檢測(cè)miRNA分子
    2.1 前言
    2.2 實(shí)驗(yàn)部分
        2.2.1 試劑與儀器
        2.2.2 DNA-RNA雜交形成Splint連接反應(yīng)體系
        2.2.3 T7核糖核酸聚合酶體外轉(zhuǎn)錄
        2.2.4 瓊脂糖凝膠電泳分析
        2.2.5 核糖核酸適體傳感器檢測(cè)miRNA的熒光測(cè)定
        2.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)及樣品制備
        2.2.7 RT-PCR定量檢測(cè)不同細(xì)胞內(nèi)miRNA21及miRNA141表達(dá)水平
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理
        2.3.2 分析方法體外響應(yīng)驗(yàn)證
        2.3.3 凝膠電泳分析
        2.3.4 傳感器對(duì)不同濃度目標(biāo)物的光譜曲線的測(cè)定
        2.3.5 分析方法的選擇性研究
        2.3.6 適體傳感器對(duì)細(xì)胞中總microRNA的測(cè)定
    2.4 小結(jié)
第3章 基于“鄰近效應(yīng)”體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生適配體生物傳感器檢測(cè)前列腺特異性抗原分子
    3.1 前言
    3.2 實(shí)驗(yàn)部分
        3.2.1 試劑與儀器
        3.2.2 抗體標(biāo)記的DNA探針的制備
        3.2.3 PSA鄰近連接反應(yīng)體系
        3.2.4 體外轉(zhuǎn)錄RNA適配體
        3.2.5 熒光測(cè)定
        3.2.6 瓊脂糖凝膠電泳分析
        3.2.7 ELISA檢測(cè)
        3.2.8 熒光定量PCR檢測(cè)
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理
        3.3.2 探針制備
        3.3.3 分析方法的體外驗(yàn)證
        3.3.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
        3.3.5 生物傳感器檢測(cè)PSA
        3.3.6 傳感器特異性研究
        3.3.7 血液中PSA的測(cè)定
    3.4 小結(jié)
第4章 遺傳編碼RNA適配體生物傳感器用于活細(xì)胞內(nèi)miR分子的比率型成像研究
    4.1 前言
    4.2 實(shí)驗(yàn)部分
        4.2.1 試劑與儀器
        4.2.2 黃酰羅丹明B-(PEG)3-二硝基氟苯共軛物的合成
        4.2.3 質(zhì)粒構(gòu)建
        4.2.4 RNA適體傳感器的體外轉(zhuǎn)錄
        4.2.5 RNA適體傳感器的體外分析
        4.2.6 瓊脂糖凝膠電泳分析
        4.2.7 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
        4.2.8 細(xì)胞成像
        4.2.9 熒光定量PCR檢測(cè)RNA適體
        4.2.10 熒光定量PCR檢測(cè)miRNA
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理
        4.3.2 黃酰羅丹B-二硝基氟苯(SR-DN)共軛物的合成與其在細(xì)胞中滲透性研究
        4.3.3 適體生物傳感器的體外優(yōu)化與合成
        4.3.4 適體生物傳感器的體外響應(yīng)實(shí)驗(yàn)
        4.3.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞成像
        4.3.6 實(shí)時(shí)定量PCR分析細(xì)胞內(nèi)生物傳感器的表達(dá)水平
        4.3.7 質(zhì)粒構(gòu)建與表征
        4.3.8 細(xì)胞共聚焦成像
    4.4 小結(jié)
第5章 單啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)魯棒比率型內(nèi)標(biāo)和RNA適配體生物傳感器用于活細(xì)胞內(nèi)mRNA分子的定量分析
    5.1 前言
    5.2 實(shí)驗(yàn)部分
        5.2.1 試劑與儀器
        5.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建
        5.2.3 RNA適體傳感器的體外轉(zhuǎn)錄
        5.2.4 RNA適體傳感器的體外分析
        5.2.5 瓊脂糖凝膠電泳分析
        5.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
        5.2.7 細(xì)胞成像
        5.2.8 熒光定量PCR檢測(cè)GFP和適配體RNA
        5.2.9 RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        5.2.10 mRNA絕對(duì)定量檢測(cè)
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理
        5.3.2 質(zhì)粒構(gòu)建示意圖
        5.3.3 質(zhì)粒構(gòu)建與表征
        5.3.4 帶有魯棒內(nèi)標(biāo)的核酸適體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞成像
        5.3.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)RNA元件的表達(dá)
        5.3.6 適體傳感器的體外響應(yīng)實(shí)驗(yàn)
        5.3.7 傳感器的體內(nèi)響應(yīng)實(shí)驗(yàn)
        5.3.8 細(xì)胞內(nèi)mRNA拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        5.3.9 ROI熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        5.3.10 不同細(xì)胞系mRNA定量研究
    5.4 小結(jié)
第6章 基于CRISPR體系轉(zhuǎn)錄激活點(diǎn)亮RNA適配體用于活細(xì)胞內(nèi)mRNA分子成像研究
    6.1 前言
    6.2 實(shí)驗(yàn)部分
        6.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        6.2.2 體外轉(zhuǎn)錄gRNA
        6.2.3 DNA體外切割實(shí)驗(yàn)
        6.2.4 瓊脂糖凝膠電泳分析
        6.2.5 質(zhì)粒構(gòu)建
        6.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
        6.2.7 細(xì)胞成像
        6.2.8 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)適配體的表達(dá)
        6.2.9 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mRNA的表達(dá)
    6.3 結(jié)果與討論
        6.3.1 工作原理
        6.3.2 質(zhì)粒表征
        6.3.3 質(zhì)粒DNA體外酶切驗(yàn)證
        6.3.4 細(xì)胞內(nèi)RNA分子激活成像
        6.3.5 藥物處理后細(xì)胞成像及RT-PCR
    6.4 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄A 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄
致謝



本文編號(hào)：3771643