本文關鍵詞：乙酰膽堿酯酶活性檢測和抑制劑篩選新方法，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)是一種絲氨酸水解酶,它的主要生物功能是在膽堿能突觸間隙處快速水解神經遞質乙酰膽堿(Acetylcholine, ATCh),使神經遞質乙酰膽堿的量維持正常水平,保證神經沖動的傳遞。AChE在臨床上是多種疾病早期診斷的標志物,在食品安全、軍事領域和環(huán)境監(jiān)測中常被用作檢測有機磷毒物的分子識別物。 老年癡呆癥,又被稱為阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD),是一種神經系統疾病,病情呈進行性發(fā)展,嚴重威脅老年人的身心健康。目前臨床上最常用的治療AD的藥物是AChE抑制劑,這些藥物多為人工合成,選擇性差,破壞外周其它膽堿能系統,存在不同程度的副作用,對AD的治療并不能取得讓人滿意的效果。高通量篩選和尋找新型的AChE天然抑制劑,可為發(fā)現治療AD的藥物開辟新途徑。 本論文以DNA穩(wěn)定的熒光銀納米簇(DNA-stabilized fluorescent silver nanoclusters, DNA-AgNCs)和香豆素460為載體,分別建立可靠、敏感的檢測AChE的活性及篩選其抑制劑的新方法。論文包括三個部分： 第一章為緒論,對AChE的結構、功能及其與阿爾茨海默癥的關系作了簡要綜述；概括了AChE活性檢測研究現狀和AChE抑制劑研究現狀。 第二章建立了一種基于DNA-AgNCs高靈敏檢測AChE活性和進行抑制劑篩選的新方法。在水相中合成的被寡聚核苷酸保護的具有熒光性質的銀納米簇具有較強的熒光,良好的光譜和光物理性質。本章首先以不同模板DNA合成了多種DNA-AgNCs,比較了它們的熒光性能及對巰基膽堿的響應。最后選定以12個胞嘧啶為模板合成的dC(12)-AgNCs用于實驗測定,因dC(12)-AgNCs具有較強的熒光且?guī)�基膽堿使dC(12)-AgNCs的熒光增強。根據氯化硫代乙酰膽堿能被AChE催化水解產生TCh; dC(12)-AgNCs與TCh反應能使dC(12)-AgNCs的熒光增強,開發(fā)了一種基于dC(12)-AgNCs的檢驗AChE活性的熒光新方法。選取了兩種AChE的典型抑制劑他克林、加蘭他敏,研究了dC(12)-AgNCs用于AChE抑制劑的篩選。本方法具有高特異性,背景干擾小,檢測靈敏度高。對AChE活性檢測的檢出限為0.00005U/mL。而且,與Ellman方法一樣,本方法操作簡單,反應快速,有望被廣泛應用到神經生物學,毒理學,藥理學等許多重要領域。 第三章介紹了一種AChE抑制劑篩選的新方法。首先從酶動力學、熒光光譜法和分子對接等方面研究了香豆素460與AChE之間的相互作用。研究表明：香豆素460對AChE的活性有一定的抑制作用,得到導致酶活力下降一半所需的抑制劑濃度為IC50=89.8±0.7μM。進而通過抑制動力學研究了香豆素460對AChE的抑制類型,結果表明為混合Ⅱ型競爭抑制,并求得KI=(7.17+0.30)×104mo1.L-1,KIs=(5.18±0.28)×104mo1·L-1,抑制常數KIKIs。熒光光譜法研究表明,香豆素460可使AChE的內源熒光猝滅,本身的熒光增強,即二者能發(fā)生熒光共振能量轉移。分子對接研究表明香豆素460與AChE的活性位點絲氨酸的羥基以共價鍵的形式結合,并與SER124形成氫鍵。最后基于熒光共振能量轉移的原理開發(fā)了一種配體親和競爭AChE抑制劑篩選的新方法。因AChE具有酪氨酸和色氨酸殘基,290nm激發(fā)時,在340nm處有熒光發(fā)射,其本身可作為FRET的供體。選擇香豆素460為熒光基準配體。在香豆素460,AChE體系中,290nm激發(fā)時,觀察到AChE中色氨酸殘基在340nm處的熒光淬滅,同時觀察到香豆素460在460nm處的特征熒光增強。當在反應體系中加入另一種藥物分子時,若該藥物小分子對AChE的抑制作用強于香豆素460,則發(fā)生競爭性結合,香豆素460部分或全部從酶分子上被置換,由于香豆素460與色氨酸殘基之間距離增大,FRET不再發(fā)生。香豆素460在460nm處的熒光強度下降,據此來確定不同未知藥物分子與AChE的結合作用。以加蘭他敏和石杉堿甲為例,研究了香豆素460和AChE復合物用于AChE抑制劑的篩選。該方法可進行同體系測定,操作簡便,成本低,且不依賴專門的儀器,有望實現高通量篩選。
【關鍵詞】：乙酰膽堿酯酶 銀納米簇 香豆素460 熒光共振能量轉移 乙酰膽堿酯酶抑制劑
【學位授予單位】：陜西師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：O657.3;O629.8
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第1章 緒論9-27
• 1.1 乙酰膽堿酯酶(AChE)簡介9-15
• 1.1.1 AChE的結構9-11
• 1.1.2 AChE的分子類型和基因結構11-12
• 1.1.3 AChE的分布及應用12-13
• 1.1.4 AChE與阿爾茨海默癥13-15
• 1.2 AChE的活性檢測研究現狀15-19
• 1.2.1 吸收光譜法15-17
• 1.2.2 熒光分析法17-19
• 1.2.3 電化學分析法19
• 1.2.4 衍射法19
• 1.3 AChE的抑制劑研究進展19-25
• 1.3.1 生物堿類21-23
• 1.3.2 萜類23
• 1.3.3 酚類23-24
• 1.3.4 黃酮類24-25
• 1.4 本論文選題思路及研究內容25-27
• 第2章 基于DNA穩(wěn)定的銀納米簇(DNA-AgNCs)測定AChE活性27-43
• 2.1 引言27-28
• 2.2 本章研究思路28
• 2.3 實驗部分28-30
• 2.3.1 試劑與方法28-29
• 2.3.2 DNA-AgNCs的合成29
• 2.3.3 DNA-AgNCs法測定AChE的活性29
• 2.3.4 DNA-AgNCs法篩選AChE抑制劑29-30
• 2.4 結果與討論30-41
• 2.4.1 實驗原理及驗證30-34
• 2.4.2 dC(12)-AgNCs用于AChE活性的檢測34-38
• 2.4.3 dC(12)-AgNCs用于AChE抑制劑的篩選38-41
• 2.5 本章小結41-43
• 第3章 基于FRET的配體親和競爭篩選AChE抑制劑43-59
• 3.1 引言43-44
• 3.2 本章研究思路44
• 3.3 實驗部分44-47
• 3.3.1 試劑與儀器44-45
• 3.3.2 溶液的配制45
• 3.3.3 香豆素460對AChE活性的影響及抑制動力學45-46
• 3.3.4 熒光法研究香豆素460與AChE的相互反應46
• 3.3.5 分子對接法研究香豆素460與AChE的相互作用46
• 3.3.6 基于FRET的配體親和同質競爭AChE抑制劑的篩選46-47
• 3.4 實驗結果與討論47-57
• 3.4.1 香豆素460對AChE的抑制動力學47-48
• 3.4.2 香豆素460與AChE的熒光共振能量轉移48-52
• 3.4.3 香豆素460與AChE的分子對接52-54
• 3.4.4 香豆素460-AChE復合物篩選AChE抑制劑54-57
• 3.5 本章小結57-59
• 結論59-61
• 參考文獻61-71
• 致謝71-73
• 攻讀學位期間研究成果73

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前2條

1 付劍亮;邵福源;;阿爾茨海默病發(fā)病機制研究進展[J];世界臨床藥物;2010年07期

2 徐恩斌,張忠兵,張雷,宋森濤,林勇,寧守斌,謝渭芬;乙酰膽堿酯酶基因治療貓賁門失弛緩癥模型的實驗研究[J];中華消化雜志;2004年06期

  本文關鍵詞：乙酰膽堿酯酶活性檢測和抑制劑篩選新方法，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：374055