森田-貝利斯-希爾曼反應(yīng)（MBH反應(yīng)）是重要的碳-碳鍵形成反應(yīng),在過去的幾十年中,MBH產(chǎn)物已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注,它可以作為含有烯基丙醇的復(fù)雜天然產(chǎn)物的有價(jià)值的組成部分。在傳統(tǒng)的化學(xué)催化中存在環(huán)境污染,反應(yīng)條件復(fù)雜等問題。目前關(guān)于酶催化MBH反應(yīng)的報(bào)道普遍存在催化效率不高的情況。本文使用酯酶、丙氨酸消旋酶、烯鍵還原酶催化MBH反應(yīng)。我們主要以硝基苯甲醛和環(huán)己烯酮為底物,磷酸緩沖液為溶劑的條件下催化MBH反應(yīng)。經(jīng)過對(duì)三種酶催化的幾個(gè)重要的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)ER具有較好的催化效果。隨后引入添加劑輔助ER催化MBH反應(yīng),并制備ER突變體期望進(jìn)一步提高酶的催化效果。我們對(duì)酯酶和丙氨酸消旋酶進(jìn)行克隆表達(dá)和蛋白純化。從枯草芽孢桿菌168（Bacillus subtilis168）基因組中獲得酯酶yitV、丙氨酸消旋酶基因alr1,在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達(dá)相應(yīng)蛋白。yitV最佳誘導(dǎo)溫度為16℃,IPTG終濃度0.01 mM,alr1最佳誘導(dǎo)溫度為25℃,IPTG終濃度0.1 mM。蛋白經(jīng)過鎳柱純化后得到純的alr1、yitV。將構(gòu)建成功的yitV、alr1和ER用于催化MBH反應(yīng)中... 

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 酶源的廣泛性
    1.2 酶催化的非專一性反應(yīng)
        1.2.1 烯鍵還原酶催化的非專一性反應(yīng)
        1.2.2 酯酶催化的非專一性反應(yīng)
        1.2.3 其它種類的酶催化的非專一性反應(yīng)
    1.3 酶催化非專一性反應(yīng)的重要性
        1.3.1 酶催化非專一性反應(yīng)的發(fā)展
        1.3.2 酶催化非專一性反應(yīng)的意義
    1.4 MBH反應(yīng)的研究
        1.4.1 MBH反應(yīng)的機(jī)理
        1.4.2 化學(xué)催化MBH反應(yīng)的研究
        1.4.3 生物催化MBH反應(yīng)
    1.5 本論文的研究思想
第二章 催化MBH反應(yīng)的酶源篩選
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料和儀器
        2.2.1 菌種與質(zhì)粒
        2.2.2 主要試劑
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.4 引物設(shè)計(jì)及酶切位點(diǎn)
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 試劑的配置
        2.3.2 酶的獲取及克隆
        2.3.3 酶的表達(dá)
        2.3.4 酶的純化
        2.3.5 酶催化MBH反應(yīng)
        2.3.6 反應(yīng)轉(zhuǎn)化率及立體選擇性的檢測(cè)方法
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 酶的克隆
        2.4.2 酶的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.4.3 酶的純化
        2.4.4 酶催化MBH反應(yīng)的建立
        2.4.5 ER催化MBH反應(yīng)條件的優(yōu)化
        2.4.6 alr1 催化MBH反應(yīng)條件的優(yōu)化
        2.4.7 yitV催化MBH反應(yīng)條件的優(yōu)化
        2.4.8 多種酶催化MBH反應(yīng)
    2.5 小結(jié)
第三章 烯鍵還原酶催化MBH反應(yīng)
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料和儀器
        3.2.1 菌種
        3.2.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.3 引物設(shè)計(jì)
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 ER突變體的獲取與克隆
        3.3.2 ER突變體的表達(dá)
        3.3.3 ER突變體的純化
        3.3.4 ER突變體催化MBH反應(yīng)
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 ER突變體基因的獲取
        3.4.2 ER突變體與載體形成的重組質(zhì)粒鑒定及表達(dá)
        3.4.3 添加劑對(duì)ER催化MBH反應(yīng)的影響
        3.4.4 ER突變體催化MBH反應(yīng)
        3.4.5 分子模擬
    3.5 小結(jié)
第四章 氨基酸催化MBH反應(yīng)
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)試劑與器材
        4.2.1 主要試劑和實(shí)驗(yàn)器材
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 氨基酸催化MBH反應(yīng)
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 單個(gè)氨基酸的篩選
        4.4.2 Pro催化MBH反應(yīng)
        4.4.3 氨基酸共催化MBH反應(yīng)
        4.4.4 酶和氨基酸共催化MBH反應(yīng)
    4.5 小結(jié)
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
在學(xué)期間的科研成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
碩士論文
[1]蛋白酶催化不對(duì)稱MBH反應(yīng)、不對(duì)稱Michael反應(yīng)及Friedel-Crafts反應(yīng)的研究[D]. 薛靖文.西南大學(xué) 2016



本文編號(hào)：3679902