核酸外切酶III（Exo III）由于不需要特定識別序列就能選擇性識別并水解雙鏈DNA的3’平末端或3’凹末端,它在構(gòu)建DNA信號擴(kuò)增的生物傳感器方面有著廣泛的應(yīng)用。隨著對小分子和蛋白質(zhì)之間相互作用的深入研究,小分子部分與其蛋白質(zhì)目標(biāo)結(jié)合產(chǎn)生的空間位阻可以保護(hù)末端與小分子相連的單鏈DNA（ss DNA）。這種小分子DNA的末端保護(hù)檢測策略操作簡單、不受DNA序列編碼的限制,與DNA信號放大檢測策略相結(jié)合,可使得末端標(biāo)記有與蛋白質(zhì)結(jié)合的小分子的DNA鏈成為檢測這些蛋白質(zhì)的理想選擇。富G堿基的DNA序列可以在Na⁺、K⁺、小分子或某些陽離子染料的誘導(dǎo)下折疊成高度有序的G-四鏈體或G-三鏈體結(jié)構(gòu),可以與熒光染料如硫黃素T（Th T）結(jié)合發(fā)出增強(qiáng)的熒光信號,在構(gòu)建熒光生物傳感器方面有著極其廣泛的應(yīng)用。Y型三向結(jié)構(gòu)由于其結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定性高等優(yōu)異的性能,還能方便地用于與目標(biāo)DNA的特異性識別,因此在許多信號放大領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。本論文主要利用G-四鏈體、G-三鏈體與熒光染料Th T結(jié)合所發(fā)出光譜的特性以及Exo III輔助下基于Y型三向結(jié)構(gòu)的DNA... 

【文章來源】：湘潭大學(xué)湖南省

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

無標(biāo)記通用熒光生物傳感器來檢測目標(biāo)DNA和凝血酶

第1章緒論3過程，具有簡單、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點。該實驗在對凝血酶與其類似物做的選擇性實驗中得到了令人滿意的結(jié)果，且在實際樣品（血清）中的加標(biāo)回收實驗表明該生物傳感器平臺可用于實際樣品檢測。圖1-2新型無標(biāo)記比率熒光探針的可視生物傳感器來檢測過氧化氫和氧化酶JieqiongChen等[36]基于GelRed/[G3T]5/Tb3+雜化構(gòu)建了一個新型無標(biāo)記比率熒光探針的可視生物傳感器平臺來對過氧化氫和氧化酶進(jìn)行檢測。其原理描繪如圖1-2所示，首先設(shè)計了GelRed/[G3T]5/Tb3+雜化是由凝膠紅GelRed和單鏈DNA[G3T]5和Tb3+構(gòu)成，然后用Hg2+和半胱氨酸(Cys)調(diào)節(jié)。其中凝膠紅是廣泛用作凝膠電泳核酸插層染色的敏感染料[37]，游離凝膠呈弱熒光；作為綠色熒光材料的鑭系離子Tb3+與鳥嘌呤的三重態(tài)能量共振能級堆疊，可以大大增強(qiáng)Tb3+的發(fā)射[38]，因此Tb3+的熒光強(qiáng)度在[G3T]5存在下顯著增強(qiáng)，呈增強(qiáng)的綠色熒光。當(dāng)凝膠化的[G3T]5和Tb3+溶液混合在一起時，它將顯示綠色熒光。加入Hg2+，Hg2+可與胸腺嘧啶(T)堿基特異性互相作用，構(gòu)成強(qiáng)而穩(wěn)固的T-Hg2+-T復(fù)合物[39]，[G3T]5/Tb3+中Tb3+的敏化熒光被有效猝滅，而凝膠[G3T]5的熒光穩(wěn)定，因此混合物呈現(xiàn)紅色熒光；在上述體系中進(jìn)一步添加Cys后，Hg2+從T-Hg2+-T絡(luò)合物中被捕捉，然后打開[G3T]5/Tb3+的熒光，因此混合物再次呈現(xiàn)綠色。該傳感器機(jī)理是基于過氧化氫與Cys之間的特異性反應(yīng)，由此產(chǎn)生的二硫化物逆轉(zhuǎn)了Cys介導(dǎo)的[G3T]5/Tb3+的熒光變化，因此加入目標(biāo)物過氧化氫后混合物呈現(xiàn)紅色熒光。由于葡萄糖氧化酶(GOx)生物催化氧化葡萄糖和乙酰膽堿酯酶/膽堿氧化酶(AChE/ChOx)級聯(lián)反應(yīng)生成過氧化氫，因此該傳感器平臺可進(jìn)一步應(yīng)用于氧化酶相關(guān)反應(yīng)的監(jiān)測。此外，該實驗還證明了它在僅使用手

第1章緒論41.2小分子DNA末端保護(hù)策略研究蛋白質(zhì)與小分子的相互作用在化學(xué)、生物學(xué)與醫(yī)學(xué)中均有重要意義[40]。隨著對小分子和蛋白質(zhì)之間相互作用的深化探討，當(dāng)小分子部分與其蛋白質(zhì)目標(biāo)結(jié)合時，末端與小分子相連的單鏈DNA(ssDNA)因受到保護(hù)而不被核酸外切酶I(ExoI)、核酸外切酶III(ExoIII)或Okenokoites黃桿菌限制性內(nèi)切酶(FokI)所水解消化[41,42]，通過這種反應(yīng)，蛋白質(zhì)檢測可以轉(zhuǎn)化為DNA檢測[43]�；谝俗⒛康摹靶》肿覦NA的末端保護(hù)”的檢測策略操作簡單，不受DNA序列編碼的限制，方便與DNA信號放大檢測策略相結(jié)合，因此末端標(biāo)記有與蛋白質(zhì)結(jié)合的小分子的DNA鏈可能是檢測這些蛋白質(zhì)的理想選擇[44]。近年來，小分子DNA末端保護(hù)策略被廣泛應(yīng)用于各種生物分子的檢測，如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmt1)和糖基化酶(hogg1)[45]、鏈霉親和素(SA)[46,47]、葉酸受體(FR)[48]、轉(zhuǎn)錄因子(TF)[49,50]、核因子kappaB(NF-κB)[51]和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)[52]等。圖1-3基于SA-生物素相互作用的熒光生物傳感器來檢測SAYueHe等[53]構(gòu)建了一個基于以聚（胸腺嘧啶）(polyT)為模板的銅納米粒(CuNPs)與ExoIII輔助的DNA循環(huán)擴(kuò)增策略、通過SA-生物素的相互作用來檢測SA。實驗原理如圖1-3所示，首先設(shè)計了一個未標(biāo)記的莖環(huán)DNA，莖環(huán)DNA包含兩個結(jié)構(gòu)域，它們根據(jù)功能的不同分別被定義為I和II。區(qū)域I（紅色）是富含胸腺嘧啶的序列(T30)，它可以有效模板化地形成熒光探針CuNPs，區(qū)域II（藍(lán)色）是觸發(fā)鏈DNA的識別域。在莖環(huán)DNA中，區(qū)域I(T30)通過與區(qū)域II


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