海藻酸裂解酶是一種重要的工具酶,廣泛應(yīng)用于寡糖制備、生物能源生產(chǎn)和制藥工程等領(lǐng)域。海藻酸分解菌擁有復(fù)雜的海藻酸分解系統(tǒng),往往在其基因組包含多個(gè)海藻酸裂解酶基因,這些酶在海藻酸降解過(guò)程中的作用模式和適應(yīng)環(huán)境條件變化的生物學(xué)意義研究的較少。本文研究了Sunxiuqinia sp.SH-52的海藻酸裂解酶SHA-6的酶學(xué)性質(zhì),在此基礎(chǔ)上分析了來(lái)自該菌的6種海藻酸裂解酶對(duì)不同環(huán)境條件的響應(yīng),同時(shí)制備了海藻酸寡糖的制備以及不同海藻酸裂解酶的降解機(jī)理進(jìn)行初步研究,獲得結(jié)果如下:1.海藻酸裂解酶SHA-6的原核表達(dá)及酶學(xué)特性分析SHA-6基因的大小為2040 bp,編碼679個(gè)氨基酸,屬于PL17家族,包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域Alginate lyase和Heparinase-II/III,對(duì)該基因成功克隆并異源表達(dá)后,酶活可達(dá)13.5 U/mg,最適pH為7.0;最適溫度為50℃;偏好性降解海藻酸;Na⁺能促進(jìn)SHA-6的酶活,而Zn²⁺和Cu²⁺抑制其活性。2.不同環(huán)境對(duì)6種海藻酸裂解酶基因表達(dá)的影響運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QPCR）的方法... 

【文章來(lái)源】：昆明理工大學(xué)云南省

【文章頁(yè)數(shù)】：116 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略詞
第一章 緒論
    1.1 海藻酸及海藻酸寡糖的應(yīng)用前景
        1.1.1 海藻酸的來(lái)源
        1.1.2 海藻酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)和特性
        1.1.3 海藻酸寡糖的制備
        1.1.4 海藻酸及其寡糖的生物學(xué)功能
    1.2 海藻酸裂解酶及其研究現(xiàn)狀
        1.2.1 包涵體變復(fù)性常見(jiàn)問(wèn)題及解決手段
        1.2.2 海藻酸裂解酶的來(lái)源和分類
        1.2.3 海藻酸裂解酶結(jié)構(gòu)域的分析
        1.2.4 海藻酸裂解酶的應(yīng)用
    1.3 微生物降解海藻酸機(jī)理的研究現(xiàn)狀及存在問(wèn)題
        1.3.1 海藻酸降解機(jī)制的研究現(xiàn)狀
        1.3.2 海藻酸降解機(jī)制研究中存在的問(wèn)題
    1.4 海藻酸結(jié)構(gòu)的鑒定
        1.4.1 酶解產(chǎn)物的分離純化和檢測(cè)
        1.4.2 酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析
            1.4.2.1 NMR
            1.4.2.2 MS
    1.5 研究意義及研究?jī)?nèi)容
        1.5.1 研究意義
        1.5.2 研究?jī)?nèi)容
第二章 海藻酸裂解酶的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 所用主要試劑及其配制
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基配方
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 聚古羅糖醛酸和聚甘露糖醛酸的制備
        2.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成
        2.2.3 Sunxiuqinia sp.SH-52的基因組提取
        2.2.4 海藻酸裂解酶基因的PCR擴(kuò)增
        2.2.5 瓊脂糖電泳檢測(cè)及目的片段回收純化
        2.2.6 質(zhì)粒的提取
        2.2.7 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.8 PCR產(chǎn)物的TA克隆
        2.2.9 目的基因與表達(dá)載體的連接
        2.2.10 目的蛋白的表達(dá)與純化
        2.2.11 包涵體蛋白的復(fù)性及純化
        2.2.12 酶活測(cè)定及酶學(xué)特性分析
        2.2.13 統(tǒng)計(jì)處理
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 聚甘露糖醛酸PolyM和聚古羅糖醛酸PolyG的制備
        2.3.2 Sunxiuqinia sp.SH-52海藻酸裂解酶的系統(tǒng)進(jìn)化分析
        2.3.3 Sunxiuqinia sp.SH-52海藻酸裂解酶SHA-6的原核表達(dá)及酶特性分析
    2.4 小結(jié)
    2.5 討論
        2.5.1 海藻酸裂解酶的序列及結(jié)構(gòu)域分析
        2.5.2 海藻酸裂解酶的包涵體解決
        2.5.3 海藻酸裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)
第三章 不同環(huán)境條件對(duì)SH-52菌株海藻酸裂解酶表達(dá)的影響
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 主要試劑及配制
        3.1.2 主要儀器
        3.1.3 去RNase處理
        3.1.4 主要培養(yǎng)基
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 海帶處理液的配制
        3.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成
        3.2.3 不同環(huán)境下菌體的生長(zhǎng)
        3.2.4 RNA的提取
        3.2.5 去除基因組DNA
        3.2.6 反轉(zhuǎn)錄cDNA
        3.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        3.2.8 QPCR
        3.2.9 相對(duì)定量分析
        3.2.10 粗酶液的提取
        3.2.11 統(tǒng)計(jì)處理
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定
    3.4 酶活水平的測(cè)定
        3.4.1 不同碳源下的粗酶活
        3.4.2 不同溫度下的粗酶活
        3.4.3 不同pH下的粗酶活
    3.5 小結(jié)
    3.6 討論
第四章 海藻酸寡糖的分離與分析
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 菌株和酶
        4.1.2 主要試劑及其配制
        4.1.3 主要儀器
        4.1.4 主要培養(yǎng)基
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 甘露糖醛酸寡糖混合物的制備
        4.2.2 甘露糖醛酸和古洛糖醛酸寡糖混合物的分離
        4.2.3 陰離子柱分離樣品
        4.2.4 TLC檢測(cè)
        4.2.5 SephadexG-10柱脫鹽
        4.2.6 海藻酸裂解酶降解產(chǎn)物的制備
        4.2.7 ~1H-NMR分析
        4.2.8 衍生化HPLC分析
        4.2.9 質(zhì)譜分析
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 甘露糖醛酸和古洛糖醛酸寡糖混合物的分離和純化
        4.3.2 海藻酸裂解酶反應(yīng)歷程的分析
        4.3.3 應(yīng)用所建立方法對(duì)海藻酸裂解酶的降解產(chǎn)物分離純化
    4.4 小結(jié)
    4.5 討論
第五章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
致謝
參考文獻(xiàn)


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]海帶生物質(zhì)的預(yù)處理及甘露醇組分的乙醇轉(zhuǎn)化研究[D]. 唐麗薇.昆明理工大學(xué) 2014
[2]解藻酸弧菌Vibrio海藻酸裂解酶系的催化特異性差異[D]. 鄧書(shū)萍.華東理工大學(xué) 2013
[3]褐藻膠酶解寡糖的制備、分離和結(jié)構(gòu)鑒定[D]. 張真慶.中國(guó)海洋大學(xué) 2003



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