發(fā)布時間：2021-10-30 17:58

　　海藻酸裂解酶是一種重要的工具酶,廣泛應(yīng)用于寡糖制備、生物能源生產(chǎn)和制藥工程等領(lǐng)域。海藻酸分解菌擁有復(fù)雜的海藻酸分解系統(tǒng),往往在其基因組包含多個海藻酸裂解酶基因,這些酶在海藻酸降解過程中的作用模式和適應(yīng)環(huán)境條件變化的生物學意義研究的較少。本文研究了Sunxiuqinia sp.SH-52的海藻酸裂解酶SHA-6的酶學性質(zhì),在此基礎(chǔ)上分析了來自該菌的6種海藻酸裂解酶對不同環(huán)境條件的響應(yīng),同時制備了海藻酸寡糖的制備以及不同海藻酸裂解酶的降解機理進行初步研究,獲得結(jié)果如下:1.海藻酸裂解酶SHA-6的原核表達及酶學特性分析SHA-6基因的大小為2040 bp,編碼679個氨基酸,屬于PL17家族,包含兩個結(jié)構(gòu)域Alginate lyase和Heparinase-II/III,對該基因成功克隆并異源表達后,酶活可達13.5 U/mg,最適pH為7.0;最適溫度為50℃;偏好性降解海藻酸;Na⁺能促進SHA-6的酶活,而Zn²⁺和Cu²⁺抑制其活性。2.不同環(huán)境對6種海藻酸裂解酶基因表達的影響運用實時熒光定量PCR（QPCR）的方法... 

【文章來源】：昆明理工大學云南省

【文章頁數(shù)】：116 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略詞
第一章 緒論
    1.1 海藻酸及海藻酸寡糖的應(yīng)用前景
        1.1.1 海藻酸的來源
        1.1.2 海藻酸的化學結(jié)構(gòu)和特性
        1.1.3 海藻酸寡糖的制備
        1.1.4 海藻酸及其寡糖的生物學功能
    1.2 海藻酸裂解酶及其研究現(xiàn)狀
        1.2.1 包涵體變復(fù)性常見問題及解決手段
        1.2.2 海藻酸裂解酶的來源和分類
        1.2.3 海藻酸裂解酶結(jié)構(gòu)域的分析
        1.2.4 海藻酸裂解酶的應(yīng)用
    1.3 微生物降解海藻酸機理的研究現(xiàn)狀及存在問題
        1.3.1 海藻酸降解機制的研究現(xiàn)狀
        1.3.2 海藻酸降解機制研究中存在的問題
    1.4 海藻酸結(jié)構(gòu)的鑒定
        1.4.1 酶解產(chǎn)物的分離純化和檢測
        1.4.2 酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析
            1.4.2.1 NMR
            1.4.2.2 MS
    1.5 研究意義及研究內(nèi)容
        1.5.1 研究意義
        1.5.2 研究內(nèi)容
第二章 海藻酸裂解酶的克隆表達及酶學性質(zhì)研究
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 所用主要試劑及其配制
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基配方
    2.2 實驗方法
        2.2.1 聚古羅糖醛酸和聚甘露糖醛酸的制備
        2.2.2 引物設(shè)計與合成
        2.2.3 Sunxiuqinia sp.SH-52的基因組提取
        2.2.4 海藻酸裂解酶基因的PCR擴增
        2.2.5 瓊脂糖電泳檢測及目的片段回收純化
        2.2.6 質(zhì)粒的提取
        2.2.7 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備
        2.2.8 PCR產(chǎn)物的TA克隆
        2.2.9 目的基因與表達載體的連接
        2.2.10 目的蛋白的表達與純化
        2.2.11 包涵體蛋白的復(fù)性及純化
        2.2.12 酶活測定及酶學特性分析
        2.2.13 統(tǒng)計處理
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 聚甘露糖醛酸PolyM和聚古羅糖醛酸PolyG的制備
        2.3.2 Sunxiuqinia sp.SH-52海藻酸裂解酶的系統(tǒng)進化分析
        2.3.3 Sunxiuqinia sp.SH-52海藻酸裂解酶SHA-6的原核表達及酶特性分析
    2.4 小結(jié)
    2.5 討論
        2.5.1 海藻酸裂解酶的序列及結(jié)構(gòu)域分析
        2.5.2 海藻酸裂解酶的包涵體解決
        2.5.3 海藻酸裂解酶的酶學性質(zhì)
第三章 不同環(huán)境條件對SH-52菌株海藻酸裂解酶表達的影響
    3.1 實驗材料
        3.1.1 主要試劑及配制
        3.1.2 主要儀器
        3.1.3 去RNase處理
        3.1.4 主要培養(yǎng)基
    3.2 實驗方法
        3.2.1 海帶處理液的配制
        3.2.2 引物設(shè)計與合成
        3.2.3 不同環(huán)境下菌體的生長
        3.2.4 RNA的提取
        3.2.5 去除基因組DNA
        3.2.6 反轉(zhuǎn)錄cDNA
        3.2.7 標準曲線的建立
        3.2.8 QPCR
        3.2.9 相對定量分析
        3.2.10 粗酶液的提取
        3.2.11 統(tǒng)計處理
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 轉(zhuǎn)錄水平測定
    3.4 酶活水平的測定
        3.4.1 不同碳源下的粗酶活
        3.4.2 不同溫度下的粗酶活
        3.4.3 不同pH下的粗酶活
    3.5 小結(jié)
    3.6 討論
第四章 海藻酸寡糖的分離與分析
    4.1 實驗材料
        4.1.1 菌株和酶
        4.1.2 主要試劑及其配制
        4.1.3 主要儀器
        4.1.4 主要培養(yǎng)基
    4.2 實驗方法
        4.2.1 甘露糖醛酸寡糖混合物的制備
        4.2.2 甘露糖醛酸和古洛糖醛酸寡糖混合物的分離
        4.2.3 陰離子柱分離樣品
        4.2.4 TLC檢測
        4.2.5 SephadexG-10柱脫鹽
        4.2.6 海藻酸裂解酶降解產(chǎn)物的制備
        4.2.7 ~1H-NMR分析
        4.2.8 衍生化HPLC分析
        4.2.9 質(zhì)譜分析
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 甘露糖醛酸和古洛糖醛酸寡糖混合物的分離和純化
        4.3.2 海藻酸裂解酶反應(yīng)歷程的分析
        4.3.3 應(yīng)用所建立方法對海藻酸裂解酶的降解產(chǎn)物分離純化
    4.4 小結(jié)
    4.5 討論
第五章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
致謝
參考文獻


【參考文獻】：
期刊論文
[1]植物乳桿菌YM-2菌株胞外多糖生物合成工藝優(yōu)化[J]. 司天昭,柳陳堅,秦曉萌,李曉然,羅義勇,楊恩.  食品科學. 2017(10)
[2]海藻酸鈉寡糖生物活性的研究進展[J]. 張玉娟,羅福文,姚子昂,李倩,吳海歌.  中國釀造. 2014(01)
[3]褐藻寡糖檢測方法的建立[J]. 聶瑩,張文靖,石波,韭澤悟,蘇東海,程永強.  中國食物與營養(yǎng). 2012(08)
[4]寡糖研究新進展[J]. 董權(quán)鋒,于榮敏.  食品與藥品. 2009(07)
[5]系列甘露糖醛酸寡糖的制備與鑒定[J]. 劉斌,王長云,張洪榮,王斌貴,魏玉西,康凱,李亮,于廣利,耿美玉,管華詩.  高等學�；瘜W學報. 2006(03)
[6]酶解褐藻膠寡糖的HPCE分析方法研究[J]. 孫燕,呂志華,王遠紅,張真慶.  中國海洋大學學報(自然科學版). 2005(06)
[7]包涵體復(fù)性的研究進展[J]. 吉清,何鳳田.  國外醫(yī)學.臨床生物化學與檢驗學分冊. 2004(06)
[8]銹凹螺褐藻膠裂解酶的分離純化及性質(zhì)研究[J]. 孫麗萍,薛長湖,許家超,李兆杰,蔡躍飄,趙雪.  中國水產(chǎn)科學. 2004(03)
[9]寡糖的分離和結(jié)構(gòu)分析方法[J]. 韓麗君,袁兆慧,范曉,王劍.  海洋科學集刊. 2004(00)
[10]包涵體重組蛋白的純化及復(fù)性[J]. 紀劍飛,張成剛.  沈陽藥科大學學報. 1998(04)

博士論文
[1]質(zhì)譜分析外源性和內(nèi)源性寡糖的方法學研究[D]. 張真慶.中國海洋大學 2006

碩士論文
[1]海帶生物質(zhì)的預(yù)處理及甘露醇組分的乙醇轉(zhuǎn)化研究[D]. 唐麗薇.昆明理工大學 2014
[2]解藻酸弧菌Vibrio海藻酸裂解酶系的催化特異性差異[D]. 鄧書萍.華東理工大學 2013
[3]褐藻膠酶解寡糖的制備、分離和結(jié)構(gòu)鑒定[D]. 張真慶.中國海洋大學 2003



本文編號：3467172