基因組DNA甲基化（DNA methylation）是重要的表觀遺傳修飾,在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,染色質(zhì)結(jié)構(gòu),胚胎發(fā)育和細(xì)胞衰老等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。精確量化DNA甲基化不僅對早期疾病診斷、預(yù)后和治療起著關(guān)鍵作用,對生化研究和新藥物研發(fā)也具有十分重要的意義。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase,簡稱DNA MTase）負(fù)責(zé)DNA甲基化的修飾,異常的DNA MTase活性可能會破壞正常的DNA甲基化模式,進(jìn)而誘發(fā)包括肺癌、乳腺癌、肝癌等在內(nèi)的多種癌癥。目前用于DNA MTase測定的傳統(tǒng)方法通常繁瑣費力且靈敏度較低。除此之外很多人還采用一些信號擴(kuò)增策略來提高檢測靈敏度,但是由于非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致檢測特異性較差,因此靈敏度并沒有得到很大的提高。所以開發(fā)準(zhǔn)確而靈敏的DNA MTase檢測方法對于了解癌癥發(fā)生機(jī)制和發(fā)現(xiàn)抗癌藥物至關(guān)重要。在本論文中,我們首次開發(fā)了一種基于單核糖核苷酸修復(fù)介導(dǎo)的連接依賴循環(huán)信號放大的新熒光方法高靈敏地檢測DNA MTase的活性。選用的核糖核酸酶（Ribonuclease HII,簡稱RNase HII）可以切除單個核糖核苷酸,導(dǎo)致信號探針的循... 

【文章來源】：山東師范大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

A基于發(fā)夾DNA酶探針的DamMTase活性檢測示意圖

山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文5圖1-1A基于發(fā)夾DNA酶探針的DamMTase活性檢測示意圖。圖1-1B基于甲基化反應(yīng)的DNA機(jī)器對DamMTase活性的檢測示意圖。1.2.2.2電化學(xué)測定法一直以來，電化學(xué)生物傳感器一直受到研究者的廣泛關(guān)注，這種方法具有以下許多優(yōu)勢：操作便捷，簡單高效，靈敏度高，響應(yīng)速度快，生產(chǎn)成本低，易于小型化等[65,66]。因此有望在研究DNA甲基化這一領(lǐng)域發(fā)揮巨大的潛力[67-69]。1.2.2.2.1結(jié)合氧化石墨烯的電化學(xué)法截止目前，電化學(xué)技術(shù)已被廣泛用于DNA的分析檢測[70-72]，。一些研究人員專注于通過電子回旋共振納米碳膜電極[68,69]和多壁碳納米管膜電極[73]對寡核苷酸中的甲基胞嘧啶和胞嘧啶直接進(jìn)行電化學(xué)氧化，以此對DNA甲基化進(jìn)行電化學(xué)測定。這些工作都是僅提供DNA甲基化信息的檢測方法。而基因特異性甲基化的電化學(xué)分析面臨的最大挑戰(zhàn)是鑒

山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文6定甲基化胞嘧啶在DNA序列中的具體位置。蔡稱心課題組[35]報告了一種檢測基因特異性甲基化和測定MTase活性的電化學(xué)方法。如方案圖1-2所示，他們使用HpaII核酸內(nèi)切酶提高實驗的選擇性，并利用氧化石墨烯（GO）的信號放大策略來進(jìn)一步提高檢測的靈敏度。他們巧妙的設(shè)計是通過固定在電極表面的DNA探針與目標(biāo)DNA雜交而開發(fā)的（從HCT116細(xì)胞中提取了來自智人p53基因第8外顯子啟動子區(qū)的137個merDNA）。實驗測定是基于報告子（硫氨酸）的電化學(xué)反應(yīng)，該報告子在M.SssIMTase的催化下發(fā)生甲基化并進(jìn)一步被核酸內(nèi)切酶HpaII裂解（HpaII[74]是基因特異性甲基化分析中廣泛使用的一種限制性酶，它能識別雙鏈對稱序列5"-CCGG-3"并催化胞嘧啶之間的雙鏈裂解），然后通過氧化石墨烯（GO）再與探針DNA的3"-末端偶聯(lián)。這種模型可以確定CpG位點的DNA甲基化，并且能夠?qū)⒛繕?biāo)DNA序列與單堿基錯配序列區(qū)分開。他們研究發(fā)現(xiàn)電化學(xué)信號與M.SssI活性呈線性關(guān)系，當(dāng)信噪比為3時，M.SssI的線性范圍為0.1-450U/mL，檢測限為（0.050.02）U/mL。這種檢測方法有諸多優(yōu)點：易于操作，有良好的特異性和較高的選擇性等。此外，他們還證明該方法可用于快速評估和篩選DNAMTase的抑制劑，并在早期疾病診斷、新抗癌藥物的研發(fā)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用意義。圖1-2基于氧化石墨烯和限制性核酸內(nèi)切酶的電化學(xué)信號擴(kuò)增用于基因特異性DNA甲基化檢測和MTase活性測定示意圖。


本文編號：3310969