人端粒酶是由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物,該復(fù)合物以自身的RNA組分為模板,在染色體末端添加TTAGGG重復(fù)序列。端粒酶活性可在大多數(shù)原發(fā)性人類腫瘤標本和腫瘤衍生細胞系中檢測到。大多數(shù)正常的人類細胞缺乏端粒酶活性,端粒隨著細胞分裂而縮短,直到無法縮短而凋亡,除了在少數(shù)增殖細胞中表達,如生殖細胞和干細胞。在大多數(shù)永生細胞和癌細胞中,核糖核蛋白端粒酶通過在染色體末端添加TTAGGG重復(fù)序列來維持端粒長度,使細胞分裂過程中的DNA損傷得到修復(fù)并使細胞可以無限增殖,甚至永生。端粒酶的維持機制是無限復(fù)制潛力的基礎(chǔ),是癌癥診斷的生物標志物。端粒酶的有效檢測對生物學和疾病診斷等方面具有重要的意義。因此,端粒酶的特異性、準確性及靈敏性檢測極具前瞻性。為了更好地測定人類惡性腫瘤中端粒酶的生物學意義和臨床意義,需要對端粒酶活性進行準確的檢測。本文采用無淬滅分子信標標記的二次信號放大策略超靈敏檢測端粒酶的方法,利用端粒酶的存在可以催化端粒重復(fù)單位（TTAGGG）n添加到端粒酶底物鏈的3’末端,產(chǎn)生端粒重復(fù)的端粒酶延伸產(chǎn)物。隨著DNA聚合酶的加入,引物沿著模板延伸取代端粒酶延伸產(chǎn)物形成雙鏈。同時... 

【文章來源】：山東師范大學山東省

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

端粒重復(fù)擴增法示意圖

山東師范大學碩士學位論文8圖1-2雜化鏈式反應(yīng)示意圖。1.3.3滾環(huán)擴增法滾環(huán)擴增法（Rollingcircleamplification,RCA）是一種由DNA聚合酶介導的恒溫酶促過程，在基因組學、蛋白質(zhì)組學、生物傳感、藥物發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域有著重要應(yīng)用。Zhang等[77]提出了一種在絕對等溫條件下“混合-檢測”一步法超靈敏的檢測癌細胞中端粒酶活性的方法。如圖1-3所示，引物的3′末端在端粒酶作用下不斷添加端粒重復(fù)單元（TTAGGG）以形成長的單鏈DNA，具有脫嘌呤/脫嘧啶位點的輔助探針可以與所得的延伸產(chǎn)物完全雜交以形成穩(wěn)定的雙鏈DNA。端粒引物在DNA聚合酶和切割酶存在的情況下與延伸序列結(jié)合，引發(fā)鏈置換反應(yīng)，產(chǎn)生RCA引物。游離3′OH末端的新DNA引物可與環(huán)狀模板雜交，在聚合酶存在下引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)，產(chǎn)生大量長的重復(fù)與信號探針互補的DNA序列，啟動核酸內(nèi)切酶誘導的信號探針的循環(huán)切割，以釋放大量熒光分子，實現(xiàn)了對單細胞內(nèi)端粒酶活性的檢測。此方法巧妙地設(shè)計了引物產(chǎn)生滾環(huán)擴增（PG-RCA）反應(yīng)，設(shè)計簡約，采用一步法和一管法，只需將檢測所需的探針和酶一起加到反應(yīng)管中，在恒溫條件下即可檢測端粒酶活性，操作簡單，耗費時間少，其端粒酶的檢測限低至3個細胞，可以進一步應(yīng)用于端粒酶抑制劑的篩選和癌細胞與正常細胞的鑒別。

山東師范大學碩士學位論文9圖1-3滾環(huán)擴增法示意圖。1.3.4指數(shù)擴增反應(yīng)指數(shù)擴增反應(yīng)技術(shù)（Exponentialamplificationreaction，EXPAR）利用擴增模板合成寡核苷酸，Tian等[78]發(fā)明了一種新型的、靈敏的、簡單可靠的端粒重復(fù)指數(shù)等溫擴增(EXPIATR)實驗法體外測定細胞提取物中的端粒酶活性。如圖1-4所示，通過兩個引物中Nt.BspQI識別（紅色）序列的結(jié)合，DNA擴增可以在一個固定的溫度下進行，通過切口酶可以切割雙鏈DNA（ds）中一條單鏈上的識別位點，聚合酶可以延伸3"末端的缺口，并取代下游的鏈。在端粒酶存在時NTS引物可作擴增模板，延伸的NTS端粒模板與NFRP引物的雜交聚合作用，在延伸的NTS模板上形成缺口，并促使聚合反應(yīng)從缺口向相反方向進行；與此同時，新形成的鏈隨后打開NFRP底物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，激活切口酶的識別位點，并在下游開始切割和延伸/置換反應(yīng)。解離的單鏈片段重復(fù)之前延伸、切割和解離的過程，繼續(xù)合成其它新的雙鏈DNA。在這個過程中，每個雙鏈DNA也會生成單鏈片段，從而達到指數(shù)擴增的目的。EXPIATR無需昂貴的熱循環(huán)實驗儀器，就可使其具備快速診斷病原體的能力；實驗操作簡單，將粗細胞提取物與反應(yīng)主混合物混合即可，即單個HeLa癌細胞中的端粒酶活性檢測可以在25min完成，實現(xiàn)超高速檢測，可應(yīng)用在實時現(xiàn)場檢測與監(jiān)測領(lǐng)域，如突發(fā)公共衛(wèi)生事件的現(xiàn)場診斷。EXPIATR采用閉管法測定，結(jié)果可靠，重現(xiàn)性好，已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、DNA和多種微生物的檢測。


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