番茄紅素是一種深紅色類胡蘿卜素,屬于C40萜類化合物。作為人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),番茄紅素具有抗氧化性、提高免疫力、預(yù)防眼部及心血管疾病等功效,是時(shí)下暢銷的保健品之一。利用基因工程大腸桿菌生產(chǎn)番茄紅素具有產(chǎn)量高,易于放大等優(yōu)點(diǎn),因此受到廣泛關(guān)注。通過向大腸桿菌宿主細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入異源甲羥戊酸(Mevalonate,MVA)途徑增加前體供給可以免于內(nèi)源調(diào)節(jié)機(jī)制控制,是構(gòu)建高產(chǎn)番茄紅素工程菌株的常用手段之一。但是,由于涉及多個(gè)操縱子和基因的協(xié)同作用,常用的質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)存在不穩(wěn)定性,并引起工程菌株的延遲期過長(zhǎng)。為了克服這些不足,構(gòu)建整合型工程菌株是有效途徑之一。為此,本論文共構(gòu)建了 3種代謝途徑拷貝數(shù)模型:1)拷貝數(shù)不可控的雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)模型;2)不完全可控的代謝途徑拷貝數(shù)模型(MVA途徑拷貝數(shù)可控);3)可控的代謝途徑拷貝數(shù)模型。利用第3種模型,結(jié)合基因組多位點(diǎn)整合策略,成功構(gòu)建出一株基于異源MVA途徑的整合型高產(chǎn)番茄紅素大腸桿菌工程菌株。主要內(nèi)容如下:一、構(gòu)建基于雙質(zhì)粒系統(tǒng)裝載MVA下游途徑和番茄紅素合成途徑的工程菌株。以整合了 MVA上游途徑操縱子的高產(chǎn)甲羥戊酸工程菌株DHGT7E為宿主,結(jié)合裝載人工合成的MVA下游途徑操縱子和番茄紅素合成途徑操縱子的雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)合成番茄紅素。拷貝數(shù)不可控的雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)采用組合優(yōu)化策略,包括2種復(fù)制子(p15Aori和pBR322 ori)和2種啟動(dòng)子(T7和T7lac)的組合,構(gòu)建出8個(gè)子模型。結(jié)果表明,利用此方法未能提高工程菌株的番茄紅素生產(chǎn)能力,8株工程菌的番茄紅素得率均低于3 mg/g DC W。二、整合型工程菌株聯(lián)合質(zhì)粒系統(tǒng)提高番茄紅素合成水平。以具備優(yōu)良生長(zhǎng)性能的E.coliDH1基因組刪減型菌株DH6為宿主,將參與番茄紅素合成的3個(gè)操縱子以及T7 RNA聚合酶基因整合到宿主的基因組上,構(gòu)建重組菌株DH411用于番茄紅素的合成。試管中,整合型菌株DH411的番茄紅素得率僅為0.66 mg/g DCW。其原因可能是合成番茄紅素相關(guān)代謝途徑需要進(jìn)一步過表達(dá)。在菌株DH411基礎(chǔ)上,利用質(zhì)粒系統(tǒng)裝載MVA下游途徑和番茄紅素合成途徑能夠顯著提高番茄紅素得率。隨后,利用質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)比較不同來源的MVA下游途徑操縱子和番茄紅素合成途徑操縱子,并優(yōu)化質(zhì)�？截悢�(shù)。當(dāng)把MVA下游途徑調(diào)整為2拷貝后,獲得菌株D111,番茄紅素得率為27.43 mg/g DCW,且異源MVA途徑拷貝數(shù)可控。三、基于MVA上游途徑基因組多位點(diǎn)整合策略構(gòu)建工程菌株。首先,探究MVA上游途徑的整合位點(diǎn)對(duì)番茄紅素合成的影響。以E.col/DH6T7為宿主,以整合位點(diǎn)為單變量,選擇分布在基因組上不同區(qū)域的4個(gè)位點(diǎn)(64區(qū)、58區(qū)、44區(qū)和lpxM位點(diǎn))。利用質(zhì)粒pCANLEfG過表達(dá)MVA下游途徑和番茄紅素合成途徑。結(jié)果表明,最優(yōu)和次優(yōu)的位點(diǎn)分別為58區(qū)和lpxM位點(diǎn)。以E.coliD111為宿主,分別將MVA上游途徑整合到58區(qū)和lpxM位點(diǎn),獲得菌株D311和D511。菌株D311的番茄紅素得率為29.57 mg/g DCW,而菌株D511具有更好的生長(zhǎng)水平(OD600nm),分別是菌株D111和D311的2.0倍和2.2倍。隨后,將58區(qū)和lpxM位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)結(jié)合,獲得含3拷貝整合型MVA上游途徑的工程菌株D711,番茄紅素得率為34.52 mg/gDCW。并且,菌株D711的生長(zhǎng)水平是D111的1.7倍。利用基因組多位點(diǎn)整合策略能夠提高菌株番茄紅素得率和生長(zhǎng)水平。利用工程菌株的綜合性能參數(shù)得出基因組多位點(diǎn)整合策略優(yōu)于質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)。四、可控的代謝途徑拷貝數(shù)模型聯(lián)合基因組多位點(diǎn)整合策略構(gòu)建具有整合型異源代謝途徑的高產(chǎn)番茄紅素工程菌株。利用可控的代謝途徑拷貝數(shù)模型得到最優(yōu)的子模型為1拷貝的MVA上游途徑、2拷貝的MVA下游途徑和3拷貝的番茄紅素合成途徑�；蚪M多位點(diǎn)整合策略是以番茄紅素合成途徑的整合位點(diǎn)為單變量,選取分布在基因組上不同區(qū)域的4個(gè)位點(diǎn)(8區(qū)、44區(qū)、58區(qū)和lpxM位點(diǎn))。整合58區(qū)和lpxM位點(diǎn)能夠分別提高番茄紅素得率和生長(zhǎng)水平。以此為基礎(chǔ),構(gòu)建整合型工程菌株DH416,番茄紅素得率為35.34 mg/g DCW,發(fā)酵水平為92.66 mg/L,OD600nm為7.09。優(yōu)化誘導(dǎo)劑添加時(shí)間后,將番茄紅素發(fā)酵水平提高到393.24 mg/L。利用5 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)20 h,番茄紅素發(fā)酵水平為1.22 g/L,平均生產(chǎn)率(Mean productivity)為61.0 mg/L/h,達(dá)到目前文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)最高水平。
【學(xué)位單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q936;O629
【部分圖文】：

在已知的超過７００多種類胡蘿卜素中，只有６種類胡蘿卜素（番茄紅素、ａ－逡逑胡蘿卜素、（３－胡蘿卜素、（３－隱黃素、玉米黃質(zhì)和葉黃素）在人體的血清中含量較多［５２，５３］。逡逑如

（乳酸脫氫酶－Ａ基因）、Ａｔ／Ｗ邋（乳酸脫氫酶基因）、（乙醇脫氫酶基因）、Ａｐ／ｗ邋（磷逡逑酸烯醇式丙酮酸合酶基因）和（乙酰輔酶Ａ：乙酰乙酰輔酶Ａ轉(zhuǎn)移酶基因），將逡逑異戊二烯的發(fā)酵水平從９５６邋ｍｇ／Ｌ提高到１８３２邋ｍｇ／Ｌ。如圖１．５，敲除Ａｏｃ／ｔ／ｌ－ｐｔｏ和ＡｐｏｘＳ逡逑可以防止醋酸的生成；敲除和Ａｏｃ／／７五分別阻止乳酸和乙醇的合成；敲除職＇逡逑阻止糖異生作用中丙酮酸向磷酸烯醇式丙酮酸（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ，邋ＰＥＰ）轉(zhuǎn)化；敲除逡逑Ａａ／ｏＺ＾則阻止ＭＶＡ途徑中間代謝物乙酰乙酰輔酶Ａ合成乙酰乙酸［５８】。逡逑Ｇｌｙｃｅｒｏｌ逡逑ｉ

４）多種改造技術(shù)結(jié)合策略逡逑Ａｊｋｕｍａｒ等人［８（）］獲得高產(chǎn)紫衫烯的五．ｃｏ／／？工程菌株后，為進(jìn)一步催化紫衫烯生成逡逑ｔａＸａｄｉｅｎ－５ａ－0ｌ邋（圖１．４），利用Ｎ－末端工程結(jié)合融合酶策略。如圖１．６，對(duì)紫杉烯－５ａ－羥逡逑化酶的Ｎ－末端序列進(jìn)行改造，并將它的ＣＰＲ氧化還原伴侶——來源于Ｔａｘ似的ＣＹＰ４５０逡逑還原酶（ＴＣＰＲ）的Ｎ－末端刪減，再連接到改造后的紫杉烯－５ｃｘ－輕化酶的Ｃ－末端。將該逡逑融合酶基因轉(zhuǎn)入高產(chǎn)紫衫烯五．ｃｏ／／工程菌株后，ｔａｘａｄｉｅｎ－５ａ－0ｌ的發(fā)酵水平為５８邋ｍｇ／Ｌ［８Ｑ］，逡逑是Ｄｅｊｏｎｇ等人［１１２］構(gòu)建的工程酵母菌的２，４００倍。Ｔａｓｈｉｒｏ等人構(gòu)建了蒎烯合成酶的突逡逑變體文庫，結(jié)合定向進(jìn)化和融合酶策略，達(dá)到目前利用五．ｃ0／／合成ａ－蒎烯的最高水平，逡逑利用搖瓶發(fā)酵２４邋ｈ，產(chǎn)量為１４０邋ｍｇ／Ｌ，是Ｓａｒｒｉａ等人［７８］的４倍。逡逑紫杉烯－Ｓａ－羥化酶邐ＣＹＰ４５0還原酶（ＴＣＰＲ邋）逡逑：邐Ｎ邋邐＼逡逑邐邐逡逑Ｎ末端邐ｒ邐Ｎ末端邐＾逡逑Ｏｆｔ—逡逑融合酶結(jié)合Ｎ末端工程逡逑圖１．６融合酶策略結(jié)合Ｎ－末端工程逡逑Ｆｉｇ．邋１．６邋Ｆｕｓｉｏｎ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｓｔｒａｔｅｇｙ邋ｃｏｍｂｉｎｅｄ邋ｗｉｔｈ邋Ｎ－ｔｅｍｉｉｎａｌ邋ＴＭ邋ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，逡逑１．３．１．７邋ＣＩＣｈＥ邋策略逡逑利用質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)存在不穩(wěn)定性

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 Ying Zhu;Yan Yang;Pingping Den;Yong Huang;Mengxiang Ni;Hongqing Fang;;Direct cloning and transplanting of large DNA fragments from Escherichia coli chromosome[J];Science China(Life Sciences);2016年10期

2 朱美勤;虞劍;周長(zhǎng)林;方宏清;;一種新的基于Red重組及I-SecI體內(nèi)切割的大腸桿菌基因組無痕刪減方法[J];生物工程學(xué)報(bào);2016年01期

3 虞劍;黃勇;周長(zhǎng)林;童貽剛;方宏清;;利用基因組比對(duì)方法尋找大腸桿菌DH1基因組中的非必需序列[J];生物技術(shù)通訊;2014年05期

本文編號(hào)：2819484