【摘要】：混合模式色譜(mixed-mode chromatography,MMC)法的發(fā)展,在復(fù)雜樣品的分離分析方面彌補(bǔ)了單一模式色譜的固有缺點(diǎn)。其中,MMC固定相中色譜配基的選擇成為了研究熱點(diǎn)。兩性離子類化合物作為一種具有仿生結(jié)構(gòu)的材料,在蛋白質(zhì)分離與分析、復(fù)性與同時(shí)純化方面引起了研究者們的興趣。因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu),該類材料作為色譜配基制備的固定相可提供多種作用力,表現(xiàn)出了明顯優(yōu)勢(shì)。在以往的工作中,許多研究小組包括我們分別利用天然結(jié)構(gòu)的磷酰膽堿(phosphorylcholine,PC)基團(tuán)及其衍生物2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿(2-methacryloyloxy ethylphosphorylcholine,MPC)作為色譜配基制備了兩性離子交換色譜(zwitterionic ion chromatography,ZIC)、親水相互作用色譜(hydrophilic interaction chromatography,HILIC)固定相以及HILIC/弱陽(yáng)離子交換相互作用(weak cation exchange chromatography,WCX)的MMC固定相,在固定相應(yīng)用于蛋白質(zhì)和許多極性小分子分離中都表現(xiàn)出很好的分離性能。此外,對(duì)大腸桿菌高效表達(dá)的包涵體復(fù)性中也有明顯優(yōu)勢(shì)。在本工作中,為了對(duì)兩性離子類材料進(jìn)行系統(tǒng)的研究,我們選用磺酸基甜菜堿(3-[N,N-dimethyl-N-(methacryloyloxyethyl)ammonium,SBMA)和羧基甜菜堿(carboxybetaine methacrylamide,CBMA)作為色譜配基,制備了同時(shí)具有離子交換色譜(ion exchange chromatography,IEC)、HILIC等不同高效液相色譜模式的MMC固定相。分別利用極性分子和蛋白質(zhì)評(píng)價(jià)了不同配基色譜的固定相保留特征和分離性能,并將其應(yīng)用于一類小分子和蛋白質(zhì)分離,以及包涵體的復(fù)性與純化研究,初步探討其分離機(jī)制和應(yīng)用。本論文包括以下四部分:1.文獻(xiàn)綜述近年來(lái),MMC法被運(yùn)用到生物醫(yī)藥的檢測(cè)、分離與分析以及蛋白質(zhì)制備等多個(gè)領(lǐng)域。MMC配基選擇是固定相發(fā)展的關(guān)鍵和核心所在,本章節(jié)主要對(duì)MMC固定相材料發(fā)展及其應(yīng)用做了綜述,也對(duì)其機(jī)理進(jìn)行了簡(jiǎn)要討論。2.以磺酸基甜菜堿為配基的混合模式色譜固定相制備、表征及性能評(píng)價(jià)磺酸基甜菜堿是磺銨兩性離子化合物的代表,具有帶正電荷的季銨離子基團(tuán)和帶負(fù)電荷的磺酸基團(tuán),其表面在廣泛p H范圍內(nèi)顯示電負(fù)性,可提供親水相互作用,同時(shí)也有離子交換作用。前者作為固定相配基時(shí)可以在親水相互作用色譜實(shí)現(xiàn)對(duì)小分子(三聚氰胺、苯及其同系物)的分離。但是,由于在磺酸基甜菜堿中的磺酸基的離子交換作用力較弱,還未見報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中,我們利用磺基甜菜堿為配基制備了硅膠基質(zhì)的MMC固定相,簡(jiǎn)稱SBMA-silica。首先,利用元素分析、傅里葉紅外光譜、熱重分析以及X射線光電子能譜表征SBMA-silica固定相的鍵合情況。結(jié)果顯示,磺基甜菜堿成功地接枝于硅膠基質(zhì)表面,元素分析計(jì)算其最佳配基密度為1.03μmol/m2,動(dòng)態(tài)吸附量為49.6mg/g。然后,分別在HILIC和IEC模式下,用核苷、堿基混合物和標(biāo)準(zhǔn)蛋白評(píng)價(jià)該固定相分離性能和保留特征,考察含水量和流動(dòng)相p H確認(rèn)SBMA-silica符合HILIC和SCX的保留規(guī)律。3.以羧基甜菜堿為配基的混合模式色譜固定相制備、表征及性能評(píng)價(jià)為了同時(shí)研究甜菜堿類離子基團(tuán)以及疏水作用對(duì)蛋白質(zhì)分離的影響,選擇兩性離子化合物羧基甜菜堿作為固定相配基。羧基甜菜堿分子與甘氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,具有良好的生物相容性,可以通過結(jié)構(gòu)中烷基鏈長(zhǎng)度調(diào)節(jié)陰/陽(yáng)離子間距,與磺基甜菜堿相比,含有陽(yáng)離子和疏水作用基團(tuán)。在本工作中,首先,核磁共振氫譜表征了合成的(6-羧基戊基)-3-丙烯酰胺基丙基二甲基銨甜菜堿單體(5-CBMA),然后以5-CBMA單體為配基制備了具有HILIC與IEC/HIC/RPLC的MMC固定相(5-CBMA-silica),并利用元素分析、紅外光譜以及X射線光電子能譜(XPS)證實(shí)將CBMA成功地鍵合到硅膠基質(zhì)表面,其鍵合密度為1.18μmol/m2,動(dòng)態(tài)吸附量為42.1 mg/g。用核苷和蛋白質(zhì)混合物評(píng)價(jià)色譜分離性能和保留特征,初步結(jié)果發(fā)現(xiàn),在HILIC模式下可以實(shí)現(xiàn)對(duì)五種核苷的基線分離,具有經(jīng)典HILIC保留特征。但是,在WAX模式、HIC模式以及RPLC模式下對(duì)蛋白分離的選擇性較低,其保留能力較弱,有待于進(jìn)一步的研究。4.以甜菜堿類材料為配基的混合模式色譜固定相對(duì)包涵體的復(fù)性與同時(shí)純化蛋白質(zhì)折疊液相色譜法(protein refolding by liquid chromatography,PFLC)是一種理想、有效和易于規(guī)模放大的蛋白質(zhì)復(fù)性與純化方法。但是,變性蛋白尤其是大腸桿菌高效表達(dá)的包涵體無(wú)活性、不溶于水,僅溶解于強(qiáng)的變性劑(如8M脲或6-7M鹽酸胍)中,其疏水性很強(qiáng)在很多固定相不保留或者保留較弱,易于重新聚集并沉淀導(dǎo)致復(fù)性效率很低。一些研究包括我們的前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),MMC固定相的多個(gè)基團(tuán)有利于變性蛋白復(fù)性與同時(shí)純化。因此,本工作中,我們分別利用制備的5-CBMA-silica、SBMA-silica對(duì)大腸桿菌中高效表達(dá)的重組人Notch配體Delta-like 1(h Dll1)包涵體進(jìn)行復(fù)性與同時(shí)純化的研究。結(jié)果顯示,兩種固定相在IEC模式下均能實(shí)現(xiàn)對(duì)rh Dll1包涵體復(fù)性與同時(shí)純化,但是,用SBMA-silica復(fù)性與同時(shí)純化的質(zhì)量回收率(56.4%)CBMA-silica(34.6%)。當(dāng)在流動(dòng)相中添加濃度為4.0 mol/L脲時(shí),SBMA-silica的質(zhì)量回收率可達(dá)60.3%,目標(biāo)蛋白純度可達(dá)98.0%,更利于rh Dll1包涵體復(fù)性與同時(shí)純化。利用圓二色譜對(duì)rh Dll1復(fù)性與同時(shí)純化前后構(gòu)象變化的測(cè)定結(jié)果顯示,經(jīng)一步色譜過程所獲得的rh Dll1構(gòu)象符合蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(α-螺旋)特征。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：O652.6
【圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述條件下研究這些固定相色譜性能和分離模式，并運(yùn)用于多種色譜模式下實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜的分離分析，同時(shí)根據(jù)多種相互作用提高包涵體的復(fù)性與同時(shí)純化效率。本工作旨于以往研究工作，對(duì)兩性離子作為色譜配基進(jìn)行系統(tǒng)性地研究，為仿生功能色譜固的發(fā)展奠定一定的基礎(chǔ)。本工作研究路線圖如圖 1-2 所示：

第二章 以磺酸基甜菜堿為配基的混合模式色譜固定相制備、表征及性能評(píng)價(jià)9 HILIC 模式下核苷保留模式測(cè)試考察改變洗脫梯度對(duì)核苷的保留影響。色譜條件同 2.3.8。 結(jié)果與討論1 SBMA-silica 色譜固定相的制備與表征SBMA 修飾的硅膠基質(zhì) MMC 固定相合成示意圖見圖 2-1。首先，將 MPTES 修飾到表面，制備出帶有巰基的硅膠（Si-MPS）；然后利用“巰基-烯烴基”點(diǎn)擊化學(xué)方法，BMA 接枝于巰基化硅膠表面制備出聚合物刷 MMC 固定相，簡(jiǎn)稱為 SBMA-silica。

A=1:1.5 7.251 0.727 1.699 A=1:1.1 6.944 0.717 1.399 A=1:1.05 5.085 0.616 1.089 A=1:1 5.003 0.536 1.065 A=1:0.96 3.273 0.404 1.032 次測(cè)定平均值所得外光譜（IR）對(duì) SBMA-silica 表面官能團(tuán)的化學(xué)組成膠表面被巰基化硅烷偶聯(lián)劑修飾后，2922 和 2853cm這是硅烷偶聯(lián)劑中的亞甲基對(duì)應(yīng)的紅外峰，巰基因特征峰，1748cm-1處為羰基的特征吸收峰，1343cm以確定 SBMA 已經(jīng)鍵合到硅膠表面。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2801106