【摘要】：綠色熒光蛋白因其自身具有熒光和易進(jìn)行基因編碼的獨(dú)特性質(zhì),已作為強(qiáng)有力的分子工具被廣泛用于生命科學(xué)研究中。隨著生物學(xué)手段和技術(shù)的不斷發(fā)展,人們?cè)趯?duì)綠色熒光蛋白的深入研究過(guò)程中,開(kāi)發(fā)出了許多基于綠色熒光蛋白的分析傳感檢測(cè)體系。其中基于GFP自發(fā)熒光和可拆分為不發(fā)熒光的片段分子的性質(zhì)所發(fā)展的split GFP的熒光互補(bǔ)體系,因其具有免標(biāo)記和信背比高的優(yōu)勢(shì),非常適合用于生化分析傳感平臺(tái)的開(kāi)發(fā)。我們課題組曾報(bào)到過(guò)基于雙分子split GFP體系(10+1體系)設(shè)計(jì)傳感器檢測(cè)激酶活性。本文中,我們利用GFP1-9作為熒光信號(hào)的報(bào)告因子,構(gòu)建了一個(gè)基于三分子split GFP互補(bǔ)體系(9+(1+1)體系)的簡(jiǎn)單通用的傳感平臺(tái),用于與革蘭氏陽(yáng)性菌侵染過(guò)程密切相關(guān)的轉(zhuǎn)肽酶活性檢測(cè)。同時(shí),也開(kāi)展了基于雙分子split GFP體系細(xì)胞膜表面成像方面的研究。具體工作如下:1.三分裂split GFP體系的構(gòu)建及優(yōu)化。通過(guò)質(zhì)粒的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)獲得純度較高的GFP1-9蛋白。同時(shí)驗(yàn)證了GFP1-9與人工合成的GFP10-11互補(bǔ)多肽片段之間能發(fā)生復(fù)合反應(yīng),并對(duì)復(fù)合反應(yīng)的時(shí)間和反應(yīng)過(guò)程中兩者的比例進(jìn)行了最優(yōu)條件的探討。該工作為后續(xù)生物傳感體系的設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。2.三分裂split GFP作為傳感平臺(tái)用于轉(zhuǎn)肽酶的活性分析及其抑制劑的篩選。文中,基于三分子split GFP熒光互補(bǔ)體系,開(kāi)發(fā)了一個(gè)靈敏的熒光turn-on的生物傳感器用于轉(zhuǎn)肽酶活性及其抑制劑的篩選。轉(zhuǎn)肽酶能催化含有其識(shí)別序列的GFP10和GFP11發(fā)生轉(zhuǎn)肽反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物多肽GFP10-11能與GFP1-9互補(bǔ)形成完整的GFP蛋白并伴隨著熒光信號(hào)的恢復(fù)。該分析方法具有較寬的線性檢測(cè)范圍(0.3-100 nM)和低的檢測(cè)限(0.16 nM)。另外,因其“一鍋法”的簡(jiǎn)單操作手段,可用于轉(zhuǎn)肽酶抑制劑的高通量篩選。此外,本分析方法的特異性和良好的抗干擾能力,使其具有可進(jìn)一步應(yīng)用到復(fù)雜體系中轉(zhuǎn)肽酶的檢測(cè)和實(shí)際食品中革蘭氏陽(yáng)性菌的分析的潛力。3.哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上雙分子split GFP體系的構(gòu)建�；陔p分子split GFP熒光互補(bǔ)體系,通過(guò)真核細(xì)胞表面表達(dá)載體pDisplay構(gòu)建的pDisplay-gfp1-10質(zhì)粒,實(shí)現(xiàn)了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜外側(cè)表達(dá)GFP1-10大片段蛋白,并能與外源加入的GFP11多肽互補(bǔ),為雙分子split GFP互補(bǔ)體系在細(xì)胞膜表面蛋白酶或分泌性酶的檢測(cè)方面提供了可能性。
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：O657.3;Q55
【圖文】：

基于 split GFP 的分析傳感體系的構(gòu)建及轉(zhuǎn)肽酶的活性檢測(cè)色團(tuán)相連接的 σ 螺旋。其中，反平行的 β 折疊是由 9-13 個(gè)氨基酸組β 折疊是通過(guò)氫鍵相連，并形成緊密封閉的桶狀結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)被包含內(nèi)。這種特殊的立體結(jié)構(gòu)使綠色熒光蛋白的生色團(tuán)被很好的保護(hù)在桶免受溶液中水合氫離子的碰撞和氧分子的猝滅[13-15]，因此，GFP 的化

基于 split GFP 的分析傳感體系的構(gòu)建及轉(zhuǎn)肽酶的活性檢測(cè)接的 σ 螺旋。其中，反平行的 β 折疊是由 9-13 個(gè)氨基過(guò)氫鍵相連，并形成緊密封閉的桶狀結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)被特殊的立體結(jié)構(gòu)使綠色熒光蛋白的生色團(tuán)被很好的保護(hù)中水合氫離子的碰撞和氧分子的猝滅[13-15]，因此，GFP圖 1.1 GFP 的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維立體結(jié)構(gòu)示意圖。

基于 split GFP 的分析傳感體系的構(gòu)建及轉(zhuǎn)肽酶的活性檢測(cè)，因此可以用 GFP 對(duì)細(xì)胞內(nèi)的 pH 進(jìn)行檢測(cè)。這種基于 G光探針通常被稱為 Phluprin，分為比率型和盈缺型兩種。低時(shí)，最大激發(fā)波長(zhǎng)的位置會(huì)從 395 nm 遷移到 475 nm，度之間的比例來(lái)對(duì) pH 值進(jìn)行定量檢測(cè)分析；而盈缺型，只在 395 nm 波長(zhǎng)處存在熒光響應(yīng)。因此，利用綠色熒光5-7.1 范圍內(nèi)的變化，并成功對(duì)線粒體、高爾基體和細(xì)胞質(zhì)anson 等在 2002 年報(bào)道了一系列新型的 GFP 突變體（de pH 探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的 pH[25]。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張敏;任慧霞;;綠色熒光蛋白在藥學(xué)研究中的應(yīng)用[J];中南藥學(xué);2008年01期

本文編號(hào)：2783656