【摘要】：綠色熒光蛋白因其自身具有熒光和易進行基因編碼的獨特性質,已作為強有力的分子工具被廣泛用于生命科學研究中。隨著生物學手段和技術的不斷發(fā)展,人們在對綠色熒光蛋白的深入研究過程中,開發(fā)出了許多基于綠色熒光蛋白的分析傳感檢測體系。其中基于GFP自發(fā)熒光和可拆分為不發(fā)熒光的片段分子的性質所發(fā)展的split GFP的熒光互補體系,因其具有免標記和信背比高的優(yōu)勢,非常適合用于生化分析傳感平臺的開發(fā)。我們課題組曾報到過基于雙分子split GFP體系(10+1體系)設計傳感器檢測激酶活性。本文中,我們利用GFP1-9作為熒光信號的報告因子,構建了一個基于三分子split GFP互補體系(9+(1+1)體系)的簡單通用的傳感平臺,用于與革蘭氏陽性菌侵染過程密切相關的轉肽酶活性檢測。同時,也開展了基于雙分子split GFP體系細胞膜表面成像方面的研究。具體工作如下:1.三分裂split GFP體系的構建及優(yōu)化。通過質粒的構建和誘導表達獲得純度較高的GFP1-9蛋白。同時驗證了GFP1-9與人工合成的GFP10-11互補多肽片段之間能發(fā)生復合反應,并對復合反應的時間和反應過程中兩者的比例進行了最優(yōu)條件的探討。該工作為后續(xù)生物傳感體系的設計和實驗進行奠定了基礎。2.三分裂split GFP作為傳感平臺用于轉肽酶的活性分析及其抑制劑的篩選。文中,基于三分子split GFP熒光互補體系,開發(fā)了一個靈敏的熒光turn-on的生物傳感器用于轉肽酶活性及其抑制劑的篩選。轉肽酶能催化含有其識別序列的GFP10和GFP11發(fā)生轉肽反應,反應產物多肽GFP10-11能與GFP1-9互補形成完整的GFP蛋白并伴隨著熒光信號的恢復。該分析方法具有較寬的線性檢測范圍(0.3-100 nM)和低的檢測限(0.16 nM)。另外,因其“一鍋法”的簡單操作手段,可用于轉肽酶抑制劑的高通量篩選。此外,本分析方法的特異性和良好的抗干擾能力,使其具有可進一步應用到復雜體系中轉肽酶的檢測和實際食品中革蘭氏陽性菌的分析的潛力。3.哺乳動物細胞膜上雙分子split GFP體系的構建�；陔p分子split GFP熒光互補體系,通過真核細胞表面表達載體pDisplay構建的pDisplay-gfp1-10質粒,實現了在哺乳動物細胞膜外側表達GFP1-10大片段蛋白,并能與外源加入的GFP11多肽互補,為雙分子split GFP互補體系在細胞膜表面蛋白酶或分泌性酶的檢測方面提供了可能性。
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：O657.3;Q55
【圖文】：

基于 split GFP 的分析傳感體系的構建及轉肽酶的活性檢測色團相連接的 σ 螺旋。其中，反平行的 β 折疊是由 9-13 個氨基酸組β 折疊是通過氫鍵相連，并形成緊密封閉的桶狀結構，熒光基團被包含內。這種特殊的立體結構使綠色熒光蛋白的生色團被很好的保護在桶免受溶液中水合氫離子的碰撞和氧分子的猝滅[13-15]，因此，GFP 的化

基于 split GFP 的分析傳感體系的構建及轉肽酶的活性檢測接的 σ 螺旋。其中，反平行的 β 折疊是由 9-13 個氨基過氫鍵相連，并形成緊密封閉的桶狀結構，熒光基團被特殊的立體結構使綠色熒光蛋白的生色團被很好的保護中水合氫離子的碰撞和氧分子的猝滅[13-15]，因此，GFP圖 1.1 GFP 的二級結構和三維立體結構示意圖。

基于 split GFP 的分析傳感體系的構建及轉肽酶的活性檢測，因此可以用 GFP 對細胞內的 pH 進行檢測。這種基于 G光探針通常被稱為 Phluprin，分為比率型和盈缺型兩種。低時，最大激發(fā)波長的位置會從 395 nm 遷移到 475 nm，度之間的比例來對 pH 值進行定量檢測分析；而盈缺型，只在 395 nm 波長處存在熒光響應。因此，利用綠色熒光5-7.1 范圍內的變化，并成功對線粒體、高爾基體和細胞質anson 等在 2002 年報道了一系列新型的 GFP 突變體（de pH 探針檢測細胞內的 pH[25]。

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 張敏;任慧霞;;綠色熒光蛋白在藥學研究中的應用[J];中南藥學;2008年01期

本文編號：2783656