【摘要】：5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hmC)是繼5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-m C)之后發(fā)現(xiàn)的第六種堿基,由TET(ten-eleven translocation)蛋白家族酶催化氧化5-mC生成,已發(fā)現(xiàn)在多種哺乳動物組織和細(xì)胞中有著豐富的表達(dá)。與5-mC相比,5-hm C含量更低,但是其在許多生物過程中發(fā)揮著獨(dú)特的生物學(xué)功能。更重要的是,越來越多的研究表明,5-hmC水平在各種癌細(xì)胞中顯著降低,這意味著它可能成為癌癥早期診斷的生物標(biāo)志物。因此,建立可靠、選擇性高且簡便的基因組中5-羥甲基胞嘧啶雙鏈DNA(5-hmC-dsDNA)檢測方法至關(guān)重要。電致化學(xué)發(fā)光(Electrogenerated chemiluminescence,ECL)分析技術(shù)因具有電化學(xué)電勢可控和化學(xué)發(fā)光靈敏度高的雙重優(yōu)勢,已廣泛應(yīng)用于生物分析,免疫分析,食品安全和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域�；诖�,本論文以5-hmC-dsDNA為研究目標(biāo),從豐富雙鏈DNA的固定化方式角度入手,建立了兩種高選擇性和高靈敏的檢測基因組中5-hmC-dsDNA的ECL生物傳感方法。全文共分為三章,主要內(nèi)容如下:第一章,首先介紹了電化學(xué)發(fā)光的基本原理和應(yīng)用,其次綜述了DNA的組成、結(jié)構(gòu)和電化學(xué)發(fā)光DNA生物傳感器的基本原理,最后總結(jié)了DNA羥甲基化及其研究進(jìn)展,并闡述了本論文的研究內(nèi)容及意義。第二章,通過使用固定探針和釕復(fù)合物標(biāo)記的報告探針作為ECL探針,結(jié)合高釕酸鉀選擇性氧化5-hmC-dsDNA,建立了一種檢測5-hmC-dsDNA的ECL生物傳感新方法。結(jié)果表明,5-hmC-dsDNA含量在0.0090%~0.5761%范圍內(nèi)時,電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與5-hmC-dsDNA含量呈良好的線性關(guān)系(R=0.9973),檢出限為0.0036%(S/N=3)。該方法可用于小鼠不同組織中5-hmC-dsDNA的檢測,并發(fā)現(xiàn)不同小鼠組織中5-hmC-dsDNA含量差異顯著:腦組織中含量最高,脾臟組織中最低,表明所建立的傳感方法可用于生物組織中5-hmC-dsDNA的檢測。第三章,基于聚腺嘌呤-金的相互作用電化學(xué)發(fā)光高靈敏檢測基因組5-hmC-dsDNA。首先通過使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(M.HhaI)對DNA序列中5-hmC的羥基進(jìn)行化學(xué)修飾,在M.Hha I存在的情況下,5-hmC-dsDNA經(jīng)巰基乙胺處理后可轉(zhuǎn)化成氨基衍生的5-hmC-dsDNA。然后將一條含有聚腺嘌呤(polyA)的DNA作為固定探針,通過聚腺嘌呤-金的特異性吸附作用將5-hmC-dsDNA固定在電極表面。最后,利用生物素-親和素的高親和作用使得親和素修飾的釕復(fù)合物結(jié)合到固定探針上,根據(jù)ECL強(qiáng)度與5-hmC-dsDNA含量之間的關(guān)系,實(shí)現(xiàn)了對5-hmC-dsDNA的高靈敏檢測。該方法對5-hmC-dsDNA的檢出限達(dá)0.0003%(S/N=3)。
【圖文】：

圖1.1雙鏈DNA分子結(jié)構(gòu)示意圖

圖 1.2 電化學(xué)免疫傳感器定量檢測基因組 DNA 中 5-hmC[75]使用雙鏈 DNA 抗體（Anti-dsDNA antibody）完成了對 5-hmCDNA）的固定，解決了上述方法只能檢測單個堿基或只能檢測 5-h們基于 5-hmC 的糖基化修飾構(gòu)建了一種檢測 5-hmC 的多通道電
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：O657.1;TP212.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 ;Review:Advances in methodology of DNA methylation assay[J];Science China(Chemistry);2011年08期

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本文編號：2679793