【摘要】：目前,人們在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了許多獸藥殘留,如抗生素、激素等,它們會通過食物鏈進(jìn)入人體內(nèi),對其健康造成極大的危害。目前,檢測這類獸藥的難點有以下幾點:1、在食物和生物樣品中的含量較低(μg/kg);2、基質(zhì)干擾嚴(yán)重;3、多種獸藥同時共存。因此,對食品或生物樣品中的獸藥殘留的檢測,迫切需要開發(fā)一些高靈敏、高特異且高通量快速的分析方法。本論文通過開發(fā)一系列新型的核酸適體編碼探針,并結(jié)合微流控芯片電泳技術(shù),構(gòu)建了一系列通用的適體傳感器用于高通量快速檢測獸藥殘留(包括:氯霉素、卡那霉素、青霉素和雌二醇等等),并對其分析性能和原理進(jìn)行了研究。相比于目前的電化學(xué)、光學(xué)適體傳感器,上述的傳感器不僅操作簡單,小巧便攜,而且具有高通量快速、抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點,在現(xiàn)場檢測中具有更為廣闊的應(yīng)用前景。本論文主要分為三部分來開展研究工作:1.基于適體探針的微芯片電泳用于食品中抗生素殘留的檢測本章工作我們基于微芯片電泳的檢測分離技術(shù),開發(fā)了一種新型無標(biāo)記、高通量、自動化的適體傳感器用于檢測食品中的氯霉素殘留。首先,在含有氯霉素的樣品中加入適體探針使其充分反應(yīng),然后,再向其中加入適體的互補(bǔ)鏈。由于適體-氯霉素(Apt-CAP)復(fù)合物無法與互補(bǔ)鏈進(jìn)一步雜交形成dsDNA,所以隨著氯霉素的增多,dsDNA會減少。最后,將上述混合物送入微芯片電泳中(MCE)進(jìn)行檢測。MCE可以分離dsDNA和Apt-CAP,并產(chǎn)生不同的熒光信號。在一定濃度范圍內(nèi),dsDNA與Apt-CAP信號的比值與目標(biāo)物的濃度成反比。在最佳的實驗條件下,該方法對0.008-1.000ng/mL的氯霉素具有良好的線性關(guān)系,檢出下限為0.003ng/mL。同時,該方法也成功應(yīng)用于不同食品中氯霉素的檢測,顯示出良好的回收率(牛奶:91.1-108%,魚類:86.1-114%),與ELISA的結(jié)果相近。該檢測方法有以下優(yōu)點:檢測過程簡單,速度快,無需信號標(biāo)記。若是目標(biāo)物的適體序列不同,就可用于同時檢測,具有高通量篩選的潛力,可應(yīng)用于食品安全中抗生素的高通量篩選。2.基于適體功能化編碼磁珠和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的微芯片電泳陣列用于同時檢測食品中的抗生素本章工作我們開發(fā)了基于微芯片電泳陣列的適體傳感器用于同時檢測卡那霉素(KANA)和氯霉素(CAP)。我們首先將兩種捕獲探針(C-DNA)修飾到磁珠上,捕獲探針的序列分為兩部分:一部分是目標(biāo)物的適體序列,另外一部分是輔助DNA(A-DNA)的互補(bǔ)序列(可與A-DNA雜交形成復(fù)合探針)。目標(biāo)物和C-DNA之間的特異性親和力會誘導(dǎo)磁珠上的復(fù)合探針解旋,A-DNA最終被目標(biāo)物取代,通過磁性分離分散在上清液中。我們?nèi)∫欢康纳锨逡?通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)生大量相應(yīng)的dsDNA。由于A-DNA的長度不同,因此擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物的長度也不同,這些擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過MCE陣列分別進(jìn)行分離檢測,由此對不同目標(biāo)物實現(xiàn)定量。此外,本方法通過加入內(nèi)標(biāo)鏈減少PCR定量的誤差。經(jīng)歷20圈熱循環(huán)后,該方法對KANA的檢測下限為0.0025nmol/L,對CAP為0.0060 nmol/L)。此外,該方法可在1小時內(nèi)檢測48個樣品,顯示出較高的檢測通量,結(jié)合適體功能化磁珠的高特異性和PCR的高擴(kuò)增能力,該方法有望應(yīng)用于食品中痕量抗生素的同時檢測。3.基于可編程發(fā)夾探針和等溫聚合酶催化目標(biāo)物循環(huán)的微芯片電泳平臺用于同時檢測尿液中小分子物質(zhì)本章工作我們基于微芯片電泳和等溫聚合酶催化目標(biāo)物循環(huán)的信號放大技術(shù),以芐氨青霉素(AMP),三磷酸腺苷(ATP)和雌二醇(E2)為檢測模型,開發(fā)了一種均相適體傳感器用于尿液中小分子的多重檢測。通過目標(biāo)物誘導(dǎo)識別PHP的區(qū)域I,打開了PHP的發(fā)夾結(jié)構(gòu),在相應(yīng)引物和Bst輔助下進(jìn)行延伸擴(kuò)增成dsDNA。被取代的目標(biāo)物會打開第二個PHP,再次啟動了另一個循環(huán),從而實現(xiàn)了等溫聚合酶催化目標(biāo)物循環(huán)(IPCTR)。我們通過對PHP中的區(qū)域III的特殊設(shè)計,使得不同類型的目標(biāo)物被轉(zhuǎn)換為不同長度的擴(kuò)增產(chǎn)物,便于MCE分離和檢測。該方法充分發(fā)揮了微芯片電泳高通量和IPCTR高擴(kuò)增能力的特點,對尿中三個目標(biāo)物表現(xiàn)出較高的靈敏性,檢測下限分別為1nmol/L(ATP),0.05nmol/L(AMP)和0.1 nmol/L(E2)。該測定方法為不同分析物檢測提供了一種簡便和通用的平臺。
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[21; 25]發(fā)展欣欣向榮，已經(jīng)開始從基礎(chǔ)研究走向?qū)嶋H應(yīng)用。圖1.1 芯片實驗室示意圖[21]Fig. 1.1 The Schematic of “l(fā)ab on chip”1.2.2 微芯片電泳概述微流控芯片電泳，在本文中簡稱微芯片電泳，，是傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳的拓展。它不僅繼承了毛細(xì)管電泳分離效率高、試劑消耗小等優(yōu)點，同時還具有分析速度快、微型化、更易集成等特點，非常適合多組分的快速分析[28]。將微芯片電泳應(yīng)用于疾病診斷和治療、環(huán)境監(jiān)測、新藥研究開發(fā)、食品安全檢測等許多領(lǐng)域，將產(chǎn)生革命性的變化，它已成為當(dāng)前生物分析化學(xué)中重要的發(fā)展方向之一。微芯片采用微機(jī)電加工技術(shù)，通過蝕刻在數(shù)平方厘米大小的基片上制作出微米級電泳微流通

微芯片電泳的進(jìn)樣通道結(jié)構(gòu)示意圖
【學(xué)位授予單位】：寧波大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：O658.9;TS207.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2634825