【摘要】：L-苯甘氨酸是一種手性非天然氨基酸,作為一種重要的原料化合物和藥物中間體,可用于合成青霉素,維及霉素,普那霉素I等β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素,也可用于抗腫瘤藥物紫衫醇的合成,在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的市場(chǎng)前景。L-苯甘氨酸主要通過(guò)化學(xué)法合成,但化學(xué)合成反應(yīng)條件劇烈、工藝復(fù)雜、副產(chǎn)物較多、產(chǎn)品光學(xué)純度較低,需要進(jìn)一步光學(xué)拆分;且合成過(guò)程中需要用到大量的有機(jī)溶劑和有毒物質(zhì),工業(yè)污染嚴(yán)重。因此,本研究圍繞L-苯甘氨酸的生物合成開(kāi)展了以下幾方面的工作:L-苯甘氨酸催化合成體系的構(gòu)建及工藝優(yōu)化;分子支架介導(dǎo)的多酶自組裝及磁性固定化;胞內(nèi)酶的比例及輔酶水平的優(yōu)化以及全細(xì)胞磁性固定化,取得的主要研究結(jié)果如下:(1)利用Bacillus cereus來(lái)源的亮氨酸脫氫酶(BcLeuDH)和Candida boidinii來(lái)源的甲酸脫氫酶(CbFDH)構(gòu)建了L-苯甘氨酸的多酶催化合成體系,并對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,該轉(zhuǎn)化體系可有效地用于L-苯甘氨酸的合成,最適轉(zhuǎn)化條件為:底物苯乙酮酸60 g/L,輔底物甲酸銨50.4 g/L,Bc LeuDH 4 U/mL,CbFDH 2 U/mL,NAD~+濃度為0.14 g/L,pH 8.0,30℃。在最優(yōu)條件下,1 L的轉(zhuǎn)化體系中,轉(zhuǎn)化反應(yīng)5 h,苯乙酮酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%,L-苯甘氨酸產(chǎn)量60.2g/L,ee值99(4)。(2)利用小蛋白CipB為分子支架制備了同時(shí)具有Bc LeuDH和CbFDH活性的兩酶共聚集體,并對(duì)其進(jìn)行磁性固定化,用于L-苯甘氨酸的多批次轉(zhuǎn)化合成。將存在于Photorhabdus luminescens中的兩種小蛋白CipA和CipB分別與BcLeuDH和CbFDH進(jìn)行融合表達(dá),并對(duì)小蛋白的種類(lèi),連接短肽的類(lèi)型以及酶的融合方式進(jìn)行了優(yōu)化,最終得到表達(dá)量和酶活最優(yōu)的融合酶AIB-L和AIB-F,分別保留了野生酶68.8(4)和52.2(4)的酶活,并大部分以酶聚集體的形式存在,且融合酶穩(wěn)定性得以提高。進(jìn)一步構(gòu)建融合酶AIB-L和AIB-F的共表達(dá)菌株,以CipB為分子支架,實(shí)現(xiàn)融合酶AIB-L和AIB-F的胞內(nèi)共聚集,得到活性酶共酶聚集體AIB-M,并檢測(cè)了AIB-M的酶活及轉(zhuǎn)化合成L-苯甘氨酸的能力,結(jié)果表明,AIB-M的轉(zhuǎn)化速率比同等酶活的游離酶提高了50(4),最后,利用磁性納米Fe_3O_4對(duì)AIB-M進(jìn)行的磁性固定化,并將固定化AIB-M用于連續(xù)多批次轉(zhuǎn)化合成L-苯甘氨酸,最終,經(jīng)過(guò)13個(gè)批次的轉(zhuǎn)化,L-苯甘氨酸的產(chǎn)量達(dá)到97.5 g/L,比單批粗酶液轉(zhuǎn)化產(chǎn)量提高了62.5(4)。(3)通過(guò)調(diào)節(jié)共表達(dá)體系中BcLeuDH和CbFDH_(A10C)的表達(dá)比例來(lái)提高全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-苯甘氨酸的效率。將重組菌株中CbFDH_(A10C)基因的拷貝數(shù)從1增加到4個(gè),當(dāng)CbFDH_(A10C)的拷貝數(shù)為3時(shí),重組菌CbFDH_(A10C)的酶活為0.45U/mL,比單拷貝菌株中酶活提高了87.5(4)。進(jìn)一步通過(guò)不同強(qiáng)度的RBS來(lái)調(diào)節(jié)共表達(dá)菌株中BcLeuDH的表達(dá),得到重組菌CHL-1,其胞內(nèi)Bc LeuDH與CbFDH_(A10C)的比值接近最佳比例2:1,Bc LeuDH和CbFDH_(A10C)的酶活分別為1.45U/mL和0.65 U/mL,全細(xì)胞催化活性提高了3.3倍。利用菌株CHL-1作為全細(xì)胞催化劑,在細(xì)胞添加量為10 g/L DCW、pH 8.0、30℃、及甲酸銨:苯乙酮酸為2∶1條件下,轉(zhuǎn)化持續(xù)5 h之后,L-苯甘氨酸的產(chǎn)量達(dá)到60 g/L,轉(zhuǎn)化率達(dá)到100(4),ee(29)99(4)。(4)胞內(nèi)輔酶水平對(duì)輔酶依賴(lài)型的催化體系具有重要影響。通過(guò)在菌株CHL-1中共表達(dá)NAD~+補(bǔ)償合成途徑的關(guān)鍵酶煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶(NAPRTase)和NAD~+合酶(NAD~+Syn)得到菌株CHL-2,使得胞內(nèi)輔酶水平提高了2.35倍,全細(xì)胞催化活性提高了56.2(4)。隨后,在培養(yǎng)基中添加20 mg/L的煙酸(NA),菌株CHL-2胞內(nèi)輔酶水平進(jìn)一步提高2.42倍,最終在胞內(nèi)關(guān)鍵酶過(guò)表達(dá)和培養(yǎng)基添加NA的共同作用下,菌株CHL-2中胞內(nèi)輔酶水平提高了9.24倍,其全細(xì)胞催化活性提高了1.4倍,全細(xì)胞生產(chǎn)效率提高了70.4(4)。在1 L轉(zhuǎn)化體系中利用菌株CHL-2作為全細(xì)胞催化劑,在相同的條件下,僅用4 h,L-苯甘氨酸的產(chǎn)量達(dá)到60 g/L,轉(zhuǎn)化率達(dá)到100(4),進(jìn)一步提高了全細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率。(5)通過(guò)對(duì)大腸桿菌細(xì)胞的磁性固定化實(shí)現(xiàn)L-苯甘氨酸全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中細(xì)胞的快速分離和回收利用。制備的磁性納米材料的表征結(jié)果顯示:Fe_3O_4和Fe_3O_4@PEI粒子均具有標(biāo)準(zhǔn)的立方結(jié)構(gòu)相晶型,粒徑在50-200 nm之間,Fe_3O_4@PEI表面PEI包覆的平均厚度約為2 nm,Fe_3O_4@PEI的表面電荷明顯高于Fe_3O_4,Fe_3O_4的等電點(diǎn)在pH 6左右,而經(jīng)PEI修飾的磁性納米粒子的等電點(diǎn)上升至pH 10左右,說(shuō)明PEI成功包覆于Fe_3O_4表面。通過(guò)對(duì)納米材料Fe_3O_4@PEI制備及吸附條件的優(yōu)化,Fe_3O_4@PEI的細(xì)胞載量達(dá)4.5 g DCW/g。利用殼聚糖包裹磁性細(xì)胞復(fù)合物的最佳濃度為0.1 g/L,SEM顯示殼聚糖成功地包覆在磁性細(xì)胞復(fù)合物表面,最終形成的固定化細(xì)胞具有超順磁性可以通過(guò)磁場(chǎng)實(shí)現(xiàn)快速分離,固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性得到提高。最終,將固定化細(xì)胞應(yīng)用于L-苯甘氨酸轉(zhuǎn)化合成,在1 L體系中,經(jīng)過(guò)7個(gè)批次的轉(zhuǎn)化,L-苯甘氨酸的產(chǎn)量達(dá)到105.5 g/L,得率達(dá)到21.1 g/g DCW,分別比游離細(xì)胞單批轉(zhuǎn)化提高了75.8(4)和2.5倍,通過(guò)細(xì)胞的磁性固定化顯著提高了L-苯甘氨酸全細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率。
【圖文】：

1.2 L-苯甘氨酸的合成方法1.2.1 L-苯甘氨酸的化學(xué)合成苯甘氨酸的化學(xué)合成研究起源于上世紀(jì)60年代的氰化鈉法，如圖1-2所示，主要生產(chǎn)廠家有日本的化學(xué)株式會(huì)社以及荷蘭的 DSM 公司。80 年代后，我國(guó)陸續(xù)有廠家開(kāi)始生產(chǎn) L-苯甘氨酸，目前多數(shù)采用工藝成熟，合成路線簡(jiǎn)單的氰化鈉法進(jìn)行生產(chǎn)。但氰化鈉法需要用到大量劇毒氰化鈉，，對(duì)參與合成過(guò)程的工作人員的身體健康有一定的危害，且生產(chǎn)形成的污水處理困難，容易造成水土污染；另外，合成產(chǎn)物為對(duì)映體混合物，需要進(jìn)一步進(jìn)行手性拆分獲得 L-苯甘氨酸，增加了生產(chǎn)成本。為避免氰化物的使用

江南大學(xué)博士論文酸，在有機(jī)酯環(huán)叔胺或活潑鹵化物的催化下，用液氨或者濃氨水氨苯甘氨酸，進(jìn)一步拆分得到光學(xué)純苯甘氨酸[3]。該方法提升了產(chǎn)物率，但此生產(chǎn)工藝操作步驟比較繁瑣，反應(yīng)條件嚴(yán)格等問(wèn)題。圖 1-2 氰化鈉法合成路線Fig. 1-2 Synthesis of phenylglycine from sodium cyanide
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：O643.36;O625.636

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2608489