發(fā)布時(shí)間：2019-07-15 19:39

【摘要】：類胡蘿卜素是一類具有多種生理功能的天然色素,具有極強(qiáng)的抗氧化能力,廣泛應(yīng)用于食品、保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域,市場(chǎng)需求量非常大。三孢布拉霉(Blakeslea trispora)生長(zhǎng)迅速,類胡蘿卜素含量高,是目前唯一已應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的微生物。但對(duì)該菌合成類胡蘿卜素的調(diào)控機(jī)制尚缺乏認(rèn)識(shí),阻礙了類胡蘿卜素合成水平的進(jìn)一步提高。crgA是在卷枝毛霉(Mucor circinelloides)中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)負(fù)調(diào)控基因,能夠抑制類胡蘿卜素的過(guò)量積累。三孢布拉霉與卷枝毛霉具有相近的系統(tǒng)分類地位,因此推測(cè)crgA在三孢布拉霉中可能存在類似的調(diào)控作用,本文基于上述假設(shè)進(jìn)行了crgA調(diào)控三孢布拉霉合成類胡蘿卜素的作用分析,以期為提高三孢布拉霉的類胡蘿卜素合成水平奠定理論基礎(chǔ)。本文以類胡蘿卜素的主要合成者三孢布拉霉負(fù)菌為研究對(duì)象,首先克隆到了crgA基因,然后利用split-marker法對(duì)該基因進(jìn)行敲除獲得?crgA菌,并對(duì)?crgA菌進(jìn)行基因回補(bǔ)。分析了三孢布拉霉野生菌、?crgA菌和C-?crgA菌產(chǎn)孢能力、類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄水平、關(guān)鍵酶酶活、產(chǎn)物代謝水平的差異,以確定crgA對(duì)三孢布拉霉合成類胡蘿卜素的調(diào)控作用。結(jié)果表明,敲除crgA后,三孢布拉霉的產(chǎn)孢能力顯著下降,而將該基因重新導(dǎo)入到?crgA菌中,產(chǎn)孢能力恢復(fù)到野生型,表明crgA參與調(diào)控孢子的形成。本文分析了三種菌hmgR、carRA和car B在不同時(shí)間的轉(zhuǎn)錄水平。?crgA菌中hmgR、car RA和car B轉(zhuǎn)錄水平較野生菌分別最大提高了1.2、1.3和1.6倍,將crgA重新導(dǎo)入后,結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄則受到明顯抑制。在酶活水平上,?crgA菌中HMG-CoA還原酶比活較野生菌最大提高了114.2%;三孢布拉霉菌絲體內(nèi)和發(fā)酵液中抗氧化酶(Catalase,CAT;Superoxide dismutase,SOD;Peroxidase,POD)比活較大的提高。在類胡蘿卜素合成水平方面,在發(fā)酵前36 h,番茄紅素迅速積累,之后逐步轉(zhuǎn)化為β-胡蘿卜素,而?crgA菌的合成和轉(zhuǎn)化速度明顯高于野生菌。至發(fā)酵120 h時(shí),?crgA菌中β-胡蘿卜素含量達(dá)到46.39 mg?L~(-1),較野生菌提高了31.2%。在代謝水平上,采用GC-MS技術(shù)對(duì)三孢布拉霉野生菌和?crgA菌在不同培養(yǎng)時(shí)間的代謝物進(jìn)行了分析,得到代謝物譜,并進(jìn)行了聚類分析。結(jié)果表明野生菌和?crgA菌存在顯著差異。?crgA菌代謝物中糖類物質(zhì)和氨基酸含量明顯低于野生菌,而類胡蘿卜素、脂肪酸和醇類物質(zhì)含量則明顯高于野生菌。由上述結(jié)果可知,crgA是三孢布拉霉的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子。基于多元統(tǒng)計(jì)模型中的主成分分析,篩選出了5個(gè)潛在的生物標(biāo)記物:肌醇、棕櫚酸、塔格糖、單硬脂酸甘油酯和苯,并以?crgA菌為出發(fā)菌株對(duì)肌醇進(jìn)行了驗(yàn)證。向培養(yǎng)基中添加不同濃度的肌醇,生物量和β-胡蘿卜素含量分別最大提高了18.3%和20.1%,表明肌醇在三孢布拉霉合成類胡蘿卜素過(guò)程中起到積極的作用。此外,本文初步探究了光照對(duì)三孢布拉霉的調(diào)控作用,將野生菌和?crgA菌分別在光照和避光的條件下培養(yǎng)。在避光培養(yǎng)時(shí),所有菌株不產(chǎn)生孢子,而β-胡蘿卜素含量顯著提高,表明光能夠刺激孢子的生成但會(huì)抑制類胡蘿卜素的合成。同時(shí)本文分析了乙酸鈉對(duì)三孢布拉霉的影響,當(dāng)乙酸鈉濃度為2 g?L~(-1)時(shí),β-胡蘿卜素含量提高了20.0%。
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圖片說(shuō)明： 類胡蘿卜素是以異戊二烯為基本單位的多烯類化學(xué)物質(zhì)，是一類廣泛存在于動(dòng)類及真菌中的天然色素。目前，已分離出的類胡蘿卜素超過(guò) 600 種。類胡蘿卜素兩類，第一類是僅由碳和氫兩種元素構(gòu)成的胡蘿卜素，其中最重要的代表是 β-胡（β-carotene）和番茄紅素（Lycopene）；第二類是胡蘿卜素的含氧衍生物。類胡是維生素 A 前體，，對(duì)人體健康有著十分重要的作用[1]。類胡蘿卜素最顯著的結(jié)構(gòu)高度不飽和、含有 3-15 個(gè)共軛雙鍵，共軛雙鍵的存在使得類胡蘿卜素具有較強(qiáng)化能力、能夠消除人體內(nèi)氧自由基[2]。因此，類胡蘿卜素在防癌抗癌、預(yù)防心腦病及維持人體健康等方面有著廣泛的應(yīng)用[3]。目前研究最為廣泛的是 β-胡蘿卜素紅素。.1 β-胡蘿卜素理化性質(zhì)β-胡蘿卜素呈深紅色，化學(xué)分子式為 C40H56，熔點(diǎn)為 184℃，其具有較強(qiáng)的極溶于水，可溶于石油醚、氯仿、甲醇等有機(jī)溶劑。β-胡蘿卜素有四種順?lè)串悩?gòu)體為反式、9-順式、13-順式、15-順式，其中反式可利用率最高[4]。β-胡蘿卜素是維的前體，且作為氧化劑，被廣泛應(yīng)用于食品和藥品工業(yè)[5]。β-胡蘿卜素結(jié)構(gòu)如圖示。
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圖片說(shuō)明： 圖 1-3 三孢布拉霉中甲羥戊酸途徑Fig.1-3 Mevalonic acid pathway in B. trispora拉霉中類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)基因的研究 途徑中，hmgR、ipi、carG、carRA、carB 等是類胡蘿卜素結(jié)素的合成，其中研究比較多的為 hmgR、carRA 和 carB。還原酶是類胡蘿卜素合成的調(diào)控位點(diǎn)，提高 HMG-COA 還水平可以增加類胡蘿卜素前體 HMG-COA 的含量，從而提高carRA 是一個(gè)融合基因，其編碼的蛋白有 A 和 R 兩個(gè)活性中肽鏈上。其中 A 具有八氫番茄紅素合成酶的活性，而 R 具目前，在利用三孢布拉霉生產(chǎn)番茄紅素時(shí)，一般采用向培養(yǎng)制劑的方法以阻斷番茄紅素的環(huán)化，但由于抑制劑普遍具有的方法抑制環(huán)化酶的活性而又不影響八氫番茄紅素合成酶難題。carB 編碼的八氫番茄紅素脫氫酶也是關(guān)鍵酶之一，能茄紅素中。carRA 和 carB 的表達(dá)受多種因素的影響，研究性激素[25]等能夠顯著提高 carRA 和 carB 的表達(dá)水平進(jìn)而提高
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：O629.4;TQ920.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 靳文斌;李克文;胥九兵;張友亮;肖兆玲;張倩;劉開昌;龔魁杰;;海藻糖的特性、功能及應(yīng)用[J];精細(xì)與專用化學(xué)品;2015年01期

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3 喻娜娜;吳翠嬌;趙巍;牛倩倩;王斌;閆志勇;錢冬萌;宋旭霞;;Split-marker重組技術(shù)構(gòu)建泛素C末端水解酶基因缺失菌株(英文)[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2012年11期

4 佘濤;虞龍;;N~+和Ti~+離子注入番茄紅素生產(chǎn)菌的誘變選育[J];中國(guó)釀造;2009年03期

5 修宇;袁其朋;;煙草和MPTA對(duì)三孢布拉氏霉合成番茄紅素的影響[J];北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2009年01期

6 李卓才;魯波;尹紅;陳志榮;;番茄紅素化學(xué)合成的研究進(jìn)展[J];合成化學(xué);2006年02期

7 李琳,吳永嫻,曾凡坤;番茄紅素的研究進(jìn)展[J];食品科學(xué);2000年05期

8 孫慶杰,丁霄霖;超臨界CO_2萃取番茄紅素的初步研究[J];食品與發(fā)酵工業(yè);1998年01期

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1 熊力;三孢布拉霉發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的代謝調(diào)控研究[D];華中科技大學(xué);2012年

2 黃欣;基于GC-MS代謝組學(xué)的肝臟毒理研究及數(shù)據(jù)處理方法[D];浙江大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2514831