【摘要】：核酸是具有多種重要功能的生物大分子,長期以來作為分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)熱點研究對象。在上世紀(jì)80年代初,Cech和Altman等發(fā)現(xiàn)了具有催化活性的RNA分子,這些RNA分子被稱為核酶(ribozyme,RNAzyme或RNA enzyme)。核酶的發(fā)現(xiàn)打破了“酶是蛋白質(zhì)”的傳統(tǒng)學(xué)術(shù)觀念,直接推動了酶學(xué)與RNA功能研究的發(fā)展。在90年代中期,Breaker和Joyce首次通過體外篩選獲得一種可以催化斷裂RNA的單鏈DNA分子,這類具有催化活性的DNA分子被稱為脫氧核酶(deoxyribozyme,DNAzyme或DNA enzyme)。脫氧核酶的發(fā)現(xiàn),拓展了DNA的功能,豐富了酶的種類,是酶學(xué)研究中一次較為重要的突破。依據(jù)催化功能不同,脫氧核酶大體分為3種類型:斷裂型、連接型以及其他類型,其中斷裂型脫氧核酶數(shù)量最多。類手槍脫氧核酶(pistol-like DNAzyme)是該類型脫氧核酶的典型代表之一,具有氧化斷裂DNA活性,由Breaker課題組于1998年通過體外篩選獲得。本論文以類手槍脫氧核酶為研究對象,對其酶學(xué)性質(zhì)、催化機制、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系以及該脫氧核酶對銅離子檢測應(yīng)用等方面進(jìn)行較為深入全面的研究與探索。首先,我們鑒定多種輔因子對類手槍脫氧核酶催化活性的影響并探討其催化機制。在分析輔因子與類手槍脫氧核酶活性關(guān)系時,我們發(fā)現(xiàn)抗壞血酸單獨存在時類手槍脫氧核酶就可以產(chǎn)生斷裂反應(yīng),加入銅離子后,斷裂程度增強。將谷胱甘肽加入到類手槍脫氧核酶/抗壞血酸反應(yīng)系統(tǒng)中,期望維持還原態(tài)抗壞血酸水平以提高斷裂效率,然而實驗數(shù)據(jù)顯示谷胱甘肽在類手槍脫氧核酶催化反應(yīng)中發(fā)揮3種作用:單獨存在時對類手槍脫氧核酶活性無作用,有效抑制抗壞血酸誘導(dǎo)的類手槍脫氧核酶催化反應(yīng)以及大幅增強銅離子對類手槍脫氧核酶催化作用。我們以新發(fā)現(xiàn)輔因子抗壞血酸和谷胱甘肽為線索,對類手槍脫氧核酶輔因子種類進(jìn)行擴展性研究,共鑒定4類(維生素類、巰基類、酚類和胺類)30種化合物對該脫氧核酶催化活性作用。在銅離子存在情況下,新確定輔因子還原性輔酶(II)、核黃素、黃素單核苷酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇、鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚、鄰苯三酚、間苯三酚、鄰苯二胺、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和羥胺。在無銅離子存在時,鑒定對苯二酚、鄰苯三酚以及鄰苯二胺有促進(jìn)催化作用。我們又以鄰苯二酚結(jié)構(gòu)為參考,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)多巴胺類化合物也可以做該脫氧核酶輔因子。上述研究表明類手槍脫氧核酶的輔因子種類廣泛、結(jié)構(gòu)多樣,需從催化機制方面做出合理解釋。抗壞血酸/二價鐵離子和過氧化氫/二價鐵離子是常用的羥自由基產(chǎn)生體系,二者對類手槍脫氧核酶無作用,表明該脫氧核酶氧化斷裂反應(yīng)與羥自由基不直接相關(guān)。在鄰苯三酚、核黃素或次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系存在時,類手槍脫氧核酶發(fā)生斷裂反應(yīng),而這三者可產(chǎn)生超氧陰離子和過氧化氫,提示脫氧核酶斷裂與之密切相關(guān)。此外,過氧化氫酶抑制該脫氧核酶催化作用以及超氧化物歧化酶促進(jìn)作用也提供了有效的輔助信息。綜合有關(guān)實驗現(xiàn)象和數(shù)據(jù),我們提出類手槍脫氧核酶催化機制為超氧陰離子和過氧化氫介導(dǎo)的DNA氧化斷裂反應(yīng)。隨后,我們對類手槍脫氧核酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系進(jìn)行研究。對該脫氧核酶催化核心15個脫氧核苷酸進(jìn)行飽和單點突變(56個突變體),在4組輔因子(抗壞血酸/銅離子、谷胱甘肽/銅離子、鄰苯三酚/銅離子和羥胺/銅離子)條件下分別鑒定突變體活性變化,發(fā)現(xiàn)高度保守脫氧核苷酸A4和C5,其他13個脫氧核苷酸的保守性與輔因子種類有關(guān),在谷胱甘肽/銅離子組,脫氧核苷酸保守性最弱,而在羥胺/銅離子組,保守性最強,表明在不同輔因子存在時,類手槍脫氧核酶脫氧核苷酸保守性具有漂移性,并發(fā)現(xiàn)突變體T8G存在單鏈構(gòu)象多態(tài)性現(xiàn)象。對高活性突變體T3G做進(jìn)一步酶學(xué)性質(zhì)表征,發(fā)現(xiàn)在優(yōu)化反應(yīng)條件下,還原性輔酶(II)單獨使用就可使類手槍脫氧核酶發(fā)生氧化斷裂反應(yīng),為該脫氧核酶催化機制增添了更多的實驗證據(jù)。最后,基于類手槍脫氧核酶斷裂活性與谷胱甘肽/銅離子濃度關(guān)系以及該脫氧核酶二級結(jié)構(gòu)特點,我們構(gòu)建了一種熒光型銅離子傳感器PL-Cu 1.0。該傳感器對銅離子具有較高的靈敏度和專一性,檢測下限為21.1 n M,銅離子濃度在80 n M-30μM內(nèi),熒光信號與濃度對數(shù)成線性關(guān)系,樣品中其他金屬離子(例如鈣、鎂離子)濃度是銅離子濃度1000倍時不干擾檢測結(jié)果。我們利用該傳感器對自來水和瓶裝水進(jìn)行了銅離子含量檢測與分析。在PLCu 1.0傳感器基礎(chǔ)上,我們做了進(jìn)一步改良優(yōu)化,選用類手槍脫氧核酶高活性突變體T3G、強熒光分子Texas-Red以及價格低廉的巰基乙醇,設(shè)計了一種改進(jìn)型銅離子傳感器PL-Cu2.0。該傳感器具有更高的檢測靈敏度,檢測下限可達(dá)3.2 n M,抗鈣、鎂等離子干擾濃度提升到10000倍,對銅制炊具內(nèi)水中銅離子含量變化進(jìn)行了較為精密的檢測。該部分研究表明類手槍脫氧核酶作為一種生物材料適合構(gòu)建DNA分子傳感器,為相關(guān)脫氧核酶傳感器研究奠定了扎實的理論與實踐基礎(chǔ)。在本論文中,我們發(fā)現(xiàn)了類手槍脫氧核酶多種類型輔因子,研究探討了其催化機制,分析明確了催化核心內(nèi)脫氧核苷酸與活性關(guān)系,并基于該脫氧核酶酶學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點構(gòu)建了2種熒光型銅離子傳感器。這些研究豐富了脫氧核酶研究內(nèi)容,拓展了脫氧核酶的應(yīng)用范圍,具有一定的酶學(xué)研究價值以及較佳的酶工程應(yīng)用效益。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：O629.8;O657.3

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本文編號：2298160