【摘要】：糖胺聚糖是一類廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞表面和細(xì)胞間基質(zhì)的線性多糖,是一種復(fù)雜的糖類大分子。一般通過(guò)共價(jià)鍵連接在核心蛋白上,以蛋白聚糖的形式存在。由于發(fā)現(xiàn)糖胺聚糖在黏液分泌過(guò)程中具有一定的粘性并具有潤(rùn)滑功能,因此又被稱為粘多糖。各種不同組織中所含有的糖胺聚糖各不相同,可以通過(guò)結(jié)合或者調(diào)控等方式在生理及病理過(guò)程中與多種蛋白產(chǎn)生相互作用,包括趨化因子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、成型素、酶和粘附分子等相互作用。另外糖胺聚糖也被認(rèn)為與許多重要疾病,如炎癥、腫瘤等,有密切關(guān)系。除了作為生物體內(nèi)重要的功能物質(zhì),糖胺聚糖也是一類重要的生物藥物,例如抗凝血藥物、抗血栓藥物、治療緩解關(guān)節(jié)炎的藥物等等。肝素作為一種抗凝血藥物,被廣泛認(rèn)為是一種具有重要生物功能和獨(dú)特化學(xué)性質(zhì)的糖胺聚糖多糖。上世紀(jì)30年代首次發(fā)現(xiàn)肝素可以有效的防止手術(shù)后血栓的生成,繼而發(fā)現(xiàn)可以治療靜脈血栓、肺栓塞、深靜脈栓塞等。但是對(duì)肝素的使用也引起了一系列不良副反應(yīng),如出血并發(fā)癥或者肝素誘發(fā)的血小板減少等等。通過(guò)對(duì)這些并發(fā)癥的研究,對(duì)凝血機(jī)理有了更好的了解,從而引出了對(duì)分級(jí)肝素——低分子肝素的開發(fā),可以對(duì)化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物特性有更好的了解。低分子肝素的定義為硫酸化的糖胺聚糖鹽平均分子量在8000 Da以下,且至少有60%的分子量分布在8000Da以下。低分子肝素是通過(guò)控制的化學(xué)法或者酶法降解使肝素分子量降低,且抗Xa因子的效價(jià)應(yīng)大于70unit/mg,抗Xa因子活性與抗Ⅱa因子活性的比值應(yīng)大于等于1.5。目前低分子肝素的生產(chǎn)工藝有以下幾類,β-消除降解法、亞硝酸降解法、酶降解法、過(guò)氧化物降解法。利用β-消除降解法生產(chǎn)的低分子肝素主要為依諾肝素鈉;利用亞硝酸降解法生產(chǎn)的低分子肝素主要品種根據(jù)分子量不同分別稱為達(dá)肝素鈉和那屈肝素鈣;利用酶降解法生產(chǎn)的低分子肝素主要為汀肝素鈉;利用過(guò)氧化物降解法生產(chǎn)的低分子肝素有帕肝素鈉。對(duì)每種低分子肝素各個(gè)國(guó)家都有明確的要求,包括平均分子量、分子量分布、抗Xa因子與抗Ⅱa因子的效價(jià)及其比值、末端結(jié)構(gòu)、硫酸化程度等等。市場(chǎng)份額最高的三種低分子肝素為依諾肝素鈉、達(dá)肝素鈉和那屈肝素鈣。在美國(guó)的肝素市場(chǎng)超過(guò)三億美元的份額當(dāng)中,70%來(lái)自于依諾肝素鈉的銷售。除了肝素與低分子肝素,還有一類化學(xué)合成的超低分子肝素,主要有磺達(dá)肝癸鈉和艾卓肝素鈉。受瘋牛病、肝素污染事件等因素的影響,尋找新的肝素產(chǎn)品生產(chǎn)途徑一直是各國(guó)科學(xué)家努力的方向,使用化學(xué)合成法生產(chǎn)肝素產(chǎn)品是首選的代替途徑�；沁_(dá)肝癸鈉肝素寡糖藥物是基于肝素中與抗凝血酶Ⅲ相互結(jié)合的作用位點(diǎn)核心五糖的結(jié)構(gòu)合成的最簡(jiǎn)潔的肝素產(chǎn)品�；沁_(dá)肝癸鈉與肝素最大的區(qū)別即為磺達(dá)肝癸鈉僅特異性的與抗Xa因子結(jié)合,并沒(méi)有藥用肝素的眾多重要的藥理學(xué)特性。另外磺達(dá)肝癸鈉的半衰期比肝素要更長(zhǎng),但是過(guò)量的抗凝血活性不能被魚精蛋白所中和。糖胺聚糖通過(guò)結(jié)合或者調(diào)控的方式在各項(xiàng)生理功能和疾病的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。對(duì)各種不同來(lái)源的糖胺聚糖的研究可以從分子水平上對(duì)功能和病理研究給予支持。對(duì)健康個(gè)體與疾病個(gè)體糖胺聚糖含量、種類、組成等方面的差異的研究有助于對(duì)生物標(biāo)志物的探索,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病診斷的輔助作用,同時(shí)對(duì)于新藥開發(fā)、藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究也有極大的幫助。因此對(duì)糖胺聚糖的提取、分離及純化技術(shù)的需求也日益強(qiáng)烈。較常見的糖胺聚糖樣品來(lái)源有各種生物組織、各類細(xì)胞以及各種體液。由于不同來(lái)源糖胺聚糖的存在形式各有差異,因此針對(duì)物理化學(xué)性質(zhì)的差異,對(duì)于不同來(lái)源糖胺聚糖的提取、分離及純化技術(shù)的開發(fā)也有所不同。隨著對(duì)糖胺聚糖生物功能和生物制藥等生物醫(yī)藥方面越來(lái)越深入的研究,對(duì)糖胺聚糖的分析技術(shù)提出了越來(lái)越高的要求。對(duì)生物樣本中糖胺聚糖的研究可以為功能和疾病研究提供分子水平的信息支持,對(duì)糖胺聚糖藥物結(jié)構(gòu)的表征對(duì)藥物安全性評(píng)估至關(guān)重要。如何提高分析的靈敏度和準(zhǔn)確度,如何更好更深入的對(duì)糖胺聚糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征是分析工作者面臨的一大挑戰(zhàn)。利用高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳色譜法、凝膠電泳法、核磁共振波譜法以及質(zhì)譜法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)糖胺聚糖結(jié)構(gòu)的表征。本論文利用親水相互作用色譜、反相色譜與毛細(xì)管電泳色譜等分離技術(shù)在線串聯(lián)各種質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)了生物醫(yī)藥相關(guān)的糖胺聚糖類藥物以及生物樣本中提取的糖胺聚糖的定性、定量分析。為糖胺聚糖類藥物結(jié)構(gòu)確證提供了簡(jiǎn)單可靠的分析方法,為生物樣品中糖胺聚糖的種類、含量、組成、健康與疾病個(gè)體差異等方面的研究提供了有效的技術(shù)手段,進(jìn)而為尋找生物標(biāo)志物以及新藥開發(fā)開拓了道路。本論文的主要研究成果如下:1.建立了一種針對(duì)依諾肝素鈉結(jié)構(gòu)確證的方法我們采用酶法降解與化學(xué)法降解相結(jié)合的樣品處理方法將非還原端、還原端及骨架結(jié)構(gòu)進(jìn)行區(qū)分,并利用親水相互作用色譜串聯(lián)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)二級(jí)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)目前已報(bào)道的依諾肝素鈉所有組成單元結(jié)構(gòu)及部分新發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了有效的分離并實(shí)現(xiàn)了全面的定性及相對(duì)定量分析。共鑒定到并定量了酶解產(chǎn)生的組成單元超過(guò)30種,包括天然存在及化學(xué)修飾后的各種肝素組成單元,及2個(gè)新結(jié)構(gòu);利用化學(xué)氧化及還原鑒定到11種末端結(jié)構(gòu)。本方法經(jīng)過(guò)重復(fù)性評(píng)價(jià),有較好的穩(wěn)定性及線性。在依諾肝素鈉注射液樣品分析中的應(yīng)用表明本方法在LMWH相似性評(píng)價(jià)方面有著很高的應(yīng)用價(jià)值。2.建立了一種針對(duì)亞硝酸降解制備低分子肝素的結(jié)構(gòu)確證的方法我們使用了一種麥芽糖修飾的親水相互作用色譜柱對(duì)復(fù)雜酸性二糖及寡糖的分離進(jìn)行了優(yōu)化。使用高分辨串聯(lián)質(zhì)譜共清晰的鑒定到亞硝酸降解制備的低分子肝素的36種基本組成單元。同時(shí)建立并驗(yàn)證了多反應(yīng)監(jiān)測(cè)二級(jí)質(zhì)譜定量分析方法對(duì)達(dá)肝素鈉和那屈肝素鈣樣品進(jìn)行了對(duì)比研究。鑒定并定量的每一部分組成單元都可以揭示這一類低分子肝素不同方面的特性,如具有抗凝血活性的功能區(qū)域、來(lái)源于原料肝素的結(jié)構(gòu)、降解反應(yīng)的切割位點(diǎn)以及由于副反應(yīng)產(chǎn)生的經(jīng)過(guò)修飾的特殊結(jié)構(gòu)等。3.介紹了一種新型串聯(lián)質(zhì)譜Interface在低分子肝素藥物分析中的應(yīng)用介紹了一種電動(dòng)泵毛細(xì)管電泳色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法,適用于分析糖胺聚糖寡糖,并使用了一種新型的interface實(shí)現(xiàn)了毛細(xì)管電泳色譜與質(zhì)譜間的完美串聯(lián)。毛細(xì)管電泳色譜分離與電噴霧效果分別使用揮發(fā)性的電解質(zhì)碳酸氫銨與含有甲醇/甲酸的鞘流液進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)現(xiàn)了對(duì)肝素二糖到低分子肝素等各種高硫酸化的肝素寡糖的在線分析,且分析時(shí)間均在10分鐘左右,為高通量分析提供了可能性。使用該方法,肝素糖鏈經(jīng)正向電泳分離后在線串聯(lián)正離子模式質(zhì)譜分析,Bottom-up 與 Top-down 兩種研究策略均有良好的重現(xiàn)性和較高的靈敏度。4.建立了一種快速分析人尿液中糖胺聚糖成分的方法通過(guò)對(duì)樣品回收率、酶解處理和二糖分析技術(shù)等進(jìn)行優(yōu)化,建立了一種可以快速對(duì)人尿液中含量極低的糖胺聚糖進(jìn)行定性定量分析的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法。本方法利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)對(duì)經(jīng)過(guò)重組肝素酶和硫酸軟骨素酶降解的尿樣中的糖胺聚糖進(jìn)行研究。這一快速靈敏的方法實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)尿樣中低水平的糖胺聚糖含量和二糖組成,可以檢測(cè)到比患有如粘多糖病等代謝疾病的患者尿樣中含量低10倍到100倍的糖胺聚糖成分。本方法可以檢測(cè)到正常人尿樣中含量極低(ng/mL)的糖胺聚糖,同時(shí)還可以檢測(cè)到炎癥、癌癥等疾病病人尿樣中糖胺聚糖含量和組成細(xì)微的差異。5.建立了一套研究新來(lái)源糖胺聚糖藥物的提取及結(jié)構(gòu)分析的方法建立了一套提取雞蛋蛋清中硫酸角質(zhì)素的方法及對(duì)所提取到的硫酸角質(zhì)素進(jìn)行色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜分析的方法。我們使用商品化的雞蛋蛋清作為原料,提取硫酸角質(zhì)素,并利用色譜串聯(lián)質(zhì)譜、核磁共振波譜等技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,以開拓硫酸角質(zhì)素的來(lái)源。對(duì)這種糖胺聚糖的研究對(duì)科學(xué)研究和藥物研發(fā)均有重要的意義。另外,本章節(jié)中介紹的方法為研究各種組織中糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)提供了研究思路。將化學(xué)降解、酶解等樣品處理方法和色譜、質(zhì)譜、核磁共振波譜等分析技術(shù)相結(jié)合,可以對(duì)未知結(jié)構(gòu)的、新來(lái)源的糖胺聚糖進(jìn)行全面的結(jié)構(gòu)表征,為功能研究提供有力的結(jié)構(gòu)信息。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TQ464;O657.63

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本文編號(hào)：2288212