【摘要】：作為一門新興的分析方法,近年來電致化學(xué)發(fā)光(ECL)受到了越來越多的關(guān)注,而新材料的開發(fā)在ECL發(fā)展過程中發(fā)揮了非常重要的作用。納米材料具有獨(dú)特的光電性能、比表面積大以及良好的生物相容性,已在ECL生物傳感領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。蛋白激酶調(diào)控的磷酸化作用與許多生命活動(dòng)密切相關(guān),而蛋白激酶的異常表達(dá)更會導(dǎo)致多種疾病及癌癥的發(fā)生,因此精確分析激酶活性及篩選相關(guān)激酶抑制劑對于疾病診斷和臨床治療具有十分重要的意義。本論文制備了多種納米材料,利用這些納米材料的光電性質(zhì)構(gòu)建新型ECL生物傳感器,并用于檢測蛋白激酶活性以及篩選激酶抑制劑,主要分為以下三部分工作:1.首先,介紹了電致化學(xué)發(fā)光的定義、特點(diǎn)以及發(fā)光試劑的分類,電化學(xué)發(fā)光作為一種與電化學(xué)技術(shù)有關(guān)的光學(xué)分析方法,兼具電化學(xué)分析和光學(xué)分析的特點(diǎn)。隨后,概述了金屬納米材料和碳氮化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)及其在電化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域中的應(yīng)用。最后,綜述了蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)和蛋白激酶的作用,蛋白激酶作為參與細(xì)胞活動(dòng)的重要激酶,其活性的異常將導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生,在激酶活性的眾多檢測方法中,基于納米材料的ECL分析方法具有獨(dú)特優(yōu)勢。2.利用Au NCs對g-C_3N_4的ECL信號的增強(qiáng)效應(yīng),構(gòu)建了一種免標(biāo)記、高靈敏且操作簡單的新型生物傳感器用于檢測蛋白激酶A(PKA)的活性。首先將g-C_3N_4溶液滴涂于玻碳電極(GCE)表面并晾干,再滴涂一層殼聚糖(CS),在EDC和NHS作用下多肽與CS發(fā)生酰胺反應(yīng)而偶聯(lián)到CS/g-C_3N_4/GCE上;在PKA和巰基三磷酸腺苷(ATP-s)的作用下,多肽的絲氨酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化反應(yīng),從而將巰基磷酸根轉(zhuǎn)移到多肽/CS/g-C_3N_4/GCE上;進(jìn)而通過Au-S作用將Au NCs捕獲于巰基磷酸化多肽修飾電極表面,使得g-C_3N_4的ECL信號大大增強(qiáng)。隨著PKA濃度的增加,捕獲到電極表面的Au NCs增多,對g-C_3N_4的ECL增強(qiáng)效應(yīng)越顯著,g-C_3N_4的ECL增強(qiáng)程度與PKA濃度呈正相關(guān),據(jù)此可實(shí)現(xiàn)對PKA活性的高靈敏和選擇性檢測。此外,比較了多肽鏈長度以及可發(fā)生磷酸化的絲氨酸位置對g-C_3N_4的ECL強(qiáng)度的影響,結(jié)果表明,隨著多肽鏈長度的增加以及磷酸化位點(diǎn)距離電極表面距離的增加,Au NCs對g-C_3N_4的ECL增強(qiáng)效應(yīng)減弱,可見Au NCs對g-C_3N_4的ECL增強(qiáng)效應(yīng)與二者之間的距離有關(guān)。本方法構(gòu)建的ECL傳感器還可用于對激酶抑制劑的篩選以及對MCF-7細(xì)胞溶解產(chǎn)物等復(fù)雜生物環(huán)境中PKA活性的靈敏檢測。3.基于g-C_3N_4和Au NPs之間的共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)(RET)構(gòu)建新型ECL生物傳感器并用于檢測PKA活性。以S_2O_8~(2-)為共反應(yīng)劑時(shí),g-C_3N_4修飾電極能夠產(chǎn)生強(qiáng)的陰極ECL信號;將多肽組裝到g-C_3N_4修飾電極表面,在PKA和ATP-s的作用下,多肽發(fā)生巰基磷酸化,進(jìn)而通過Au-S鍵將Au NPs捕獲到多肽的巰基磷酸化位點(diǎn)上,拉近了Au NPs與g-C_3N_4之間的距離,且g-C_3N_4的ECL發(fā)射光譜和Au NPs的吸收光譜部分重疊,使得g-C_3N_4能夠?qū)⒛芰哭D(zhuǎn)移給Au NPs,g-C_3N_4的ECL強(qiáng)度降低,g-C_3N_4的ECL信號降低程度與PKA的濃度呈正相關(guān),據(jù)此可實(shí)現(xiàn)對PKA活性的定量檢測,線性范圍為0.1-80 U/mL,檢測限為0.05U/mL。同時(shí),還比較了多肽鏈長度以及Au NPs與g-C_3N_4之間的距離遠(yuǎn)近對ECL-RET的影響。此外,本方法還可用于血清樣品中激酶活性的檢測及其抑制劑的篩選,對生物化學(xué)基礎(chǔ)研究和疾病診斷等領(lǐng)域都具有重要意義。
[Abstract]:As a new analytical method, electrochemiluminescence (ECL) has attracted more and more attention in recent years, and the development of new materials plays a very important role in the development of ECL. The phosphorylation regulated by protein kinase is closely related to many life activities, and the abnormal expression of protein kinase can lead to many diseases and cancers. Therefore, it is very important to accurately analyze the kinase activity and screen the kinase inhibitors for disease diagnosis and clinical treatment. Material, using the photoelectric properties of these nanomaterials to construct new ECL biosensors, and used to detect protein kinase activity and screen kinase inhibitors, the main work is divided into three parts: 1. First, the definition of electrochemiluminescence, characteristics and classification of luminescent reagents, electrochemiluminescence as a kind of electrochemical technology and electrochemical technology. The related optical analysis methods have the characteristics of both electrochemical analysis and optical analysis. Then, the structure and properties of metal nanomaterials and carbonitrides and their applications in the field of electrochemiluminescence are summarized. Finally, protein phosphorylation and the role of protein kinase are reviewed. Protein kinase is an important part of cell activity. The abnormal activity of kinases will lead to many diseases. Among the various methods of detecting kinase activity, the ECL analysis method based on nano-materials has unique advantages. 2. A novel label-free, highly sensitive and easy-to-operate biosensor was constructed to detect protein stimulation by using the enhancement effect of Au NCs on the ECL signal of g-C_3N_4. Enzyme A (PKA) activity. First, the g-C_3N_4 solution was dripped on the surface of glassy carbon electrode (GCE) and dried, then coated with a layer of chitosan (CS). Under the action of EDC and NHS, the peptides reacted with CS amide and were coupled to CS/g-C_3N_4/GCE. Under the action of PKA and ATP-s, the serine sites of the peptides were phosphorylated, which led to the phosphorylation of the peptides. The ECL signal of g-C_3N_4 was greatly enhanced by the transfer of mercaptophosphate to polypeptide/CS/g-C_3N_4/GCE and the capture of Au-NCs onto the surface of the electrode modified by mercaptophosphate through Au-S interaction. In addition, the effects of the length of polypeptide chain and the position of serine phosphorylated on the ECL strength of g-C_3N_4 were compared. The results showed that with the increase of the length of polypeptide chain and the distance between phosphorylated site and electrode surface, Au NCs could detect the activity of g-C_3N_4 with high sensitivity and selectivity. The enhanced effect of Au NCs on the ECL of g-C_3N_4 was weakened, which indicated that the enhanced effect of Au NCs on the ECL of g-C_3N_4 was related to the distance between the two. The ECL sensor constructed by this method can also be used to screen kinase inhibitors and detect the activity of PKA in complex biological environment such as MCF-7 cell lysates. The G-C_3N_4 modified electrode can produce strong cathodic ECL signal when S_2O_8~ (2-) is used as co-reactant, and the polypeptide is assembled on the surface of g-C_3N_4 modified electrode. Under the action of PKA and ATP-s, the polypeptide undergoes sulfhydryl phosphorylation, and then the polypeptide is captured by Au-S bond. The distance between Au NPs and g-C_3N_4 was shortened at the thiol phosphorylation site of Au-C_3N_4, and the ECL emission spectra of g-C_3N_4 and the absorption spectra of Au NPs were partly overlapped. As a result, the ECL intensity of g-C_3N_4 could be transferred to Au-NPs, the ECL intensity of g-C_3N_4 decreased, and the ECL signal intensity of g-C_3N_4 decreased positively correlated with the concentration of PKA. Quantitative detection showed that the linear range was 0.1-80 U/mL and the detection limit was 0.05 U/mL. The effects of the length of polypeptide chain and the distance between Au NPs and g-C_3N_4 on ECL-RET were also compared. In addition, this method can be used for the detection of kinase activity in serum samples and the screening of inhibitors, basic biochemical research and disease diagnosis. Both are of great significance.
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：O657.1;O629.8;TP212.3

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本文編號：2210959