【摘要】：生物傳感器是將目標(biāo)識別轉(zhuǎn)換為物理可檢測的信號(例如光學(xué),電子質(zhì)量或磁信號)的裝置。通常,生物傳感器包含兩個基本上功能的組分:目標(biāo)識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。理論上,識別組件是傳感器性能的關(guān)鍵。理想的識別組件應(yīng)具有高靈敏度,令人羨慕的選擇性,快速響應(yīng),強(qiáng)大的性能和各種目標(biāo)的通用性等特點(diǎn)。隨著生化分析領(lǐng)域的不斷發(fā)展,單一的生物傳感器已經(jīng)無法滿足我們的需要。由于生物小分子無法直接進(jìn)行擴(kuò)增、待測物濃度太低等各種各樣的局限性,因此大力發(fā)展信號放大技術(shù)已經(jīng)成為了生物化學(xué)分析領(lǐng)域的工作要點(diǎn)。本文主要介紹了利用DNA酶循環(huán)放大方法和DNA自組裝擴(kuò)增等方法,實(shí)現(xiàn)了DNA和生物小分子的高靈敏度、高特異性、高選擇性、快速直接的檢測。主要包括以下三個方面:1.DNA甲基化和MTase活性的分析在癌癥的早期臨床診斷中非常重要,目的是提供對基因阻遏機(jī)制的洞察和開發(fā)治療甲基化相關(guān)疾病的新藥物。結(jié)合樹枝狀滾環(huán)擴(kuò)增和DNA酶特異性識別作用,構(gòu)建了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶檢測的新的熒光方法。在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MTase)的存在下,雙鏈DNA探針被甲基化,生成限制性內(nèi)切核酸酶DpnI的特異性識別位點(diǎn)。然后切割的雜交DNA探針作為信號引物起作用,以啟動樹狀滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。隨后,滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)生與Mg2+依賴性DNA酶的互補(bǔ)序列,在Mg2+存在下釋放熒光信號。該方法對DNA甲基化酶的檢測限達(dá)0.36 U/m L,線性范圍為1.0?10 U/mL。此外,利用該方法可以評估和篩選MTase的抑制劑,這可能有助于發(fā)現(xiàn)抗癌藥物。2.基于三通交叉結(jié)構(gòu)和自組裝循環(huán)放大技術(shù)熒光檢測DNA,利用目標(biāo)DNA觸發(fā)三通(3-WJ)結(jié)構(gòu)以及DNA酶的聚合剪切作用,結(jié)合DNA自組裝技術(shù)(CHA)對檢測信號進(jìn)行二次放大,設(shè)計了一種高度特異性、靈敏性、快速的DNA檢測方法。CHA作為一種酶信號擴(kuò)增技術(shù),已被多次使用在設(shè)催化擴(kuò)增反應(yīng)的方案中。目標(biāo)DNA與3-WJ引物和3-WJ模板緊密結(jié)合形成穩(wěn)定的3-WJ結(jié)構(gòu),在DNA聚合酶和剪切酶作用下形成引物鏈,這些引物鏈包含多段催化發(fā)卡探針自組裝的催化序列,可以通過互補(bǔ)雜交的方式打開發(fā)夾探針H1和H2,引發(fā)自組裝反應(yīng),對信號進(jìn)行二次放大。反應(yīng)后釋放熒光探針,通過兩步循環(huán)放大技術(shù),實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)DNA的高靈敏度、高選擇性檢測。3.基于酪胺酶信號放大新型免疫傳感器,用于高度靈敏的檢測凝血酶。本體系利用凝血酶及其兩條適體的特異性結(jié)合將磁性微球與金納米粒子相連,形成一個磁性微球-凝血酶-金納米粒子的復(fù)合結(jié)構(gòu)。同時,將酪胺與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合,與上一復(fù)合物相連,形成信號放大。HRP催化反應(yīng)底物過氧化氫氧以及對羥基苯乙酸。通過對熒光信號的檢測,實(shí)現(xiàn)對腫瘤標(biāo)志物凝血酶的靈敏度檢測。
[Abstract]:Biosensors are devices that convert target recognition into physically detectable signals, such as optical, electronic mass or magnetic signals. Typically, biosensors contain two basic functional components: target recognition and signal transduction. In theory, the identification component is the key to sensor performance. The ideal identification module should be characterized by high sensitivity, enviable selectivity, rapid response, strong performance and versatility of various targets. With the development of biochemical analysis, a single biosensor can not meet our needs. Because the biological small molecules can not be amplified directly and the concentration of the samples is too low, the development of signal amplification technology has become the key point in the field of biochemistry analysis. In this paper, we mainly introduce the methods of DNA enzyme cycle amplification and DNA self-assembly amplification to realize the high sensitivity, high specificity, high selectivity and rapid and direct detection of DNA and biological small molecules. The analysis of DNA methylation and MTase activity is very important in the early clinical diagnosis of cancer. The aim is to provide insight into the mechanism of gene repression and to develop new drugs for the treatment of methylation-related diseases. A new fluorescence method for the detection of DNA methyltransferase was constructed by combining the dendritic rolling ring amplification and the specific recognition of DNA. In the presence of DNA methyltransferase (MTase), the double-stranded DNA probe was methylated to form a specific recognition site for restriction endonuclease DpnI. Then the cut hybrid DNA probe acted as a signal primer to initiate the dendritic rolling ring amplification reaction. Subsequently, the rolling amplification produced complementary sequences with Mg2 dependent DNA enzymes and released fluorescence signals in the presence of Mg2. The detection limit of DNA methylase was 0.36 UmL, and the linear range was 1.0 渭 10 UmL. In addition, the method can be used to evaluate and screen inhibitors of MTase, which may be helpful in the detection of anticancer drugs. 2. 2. Based on the three-way cross structure and self-assembly cyclic amplification technique, the detection signal was re-amplified by using the target DNA triggered three-way (3-WJ) structure and the polymeric shear action of DNA enzyme, combined with the DNA self-assembly technique (CHA). As an enzyme signal amplification technique, a highly specific, sensitive and rapid DNA detection method, cha, has been used in the catalytic amplification reaction for many times. The target DNA tightly binds with 3-WJ primers and 3-WJ templates to form a stable 3-WJ structure, forming primer chains under the action of DNA polymerase and shearing enzyme. These primer chains contain self-assembled catalytic sequences of multi-segment catalytic hairpin probes. The hairpin probes H1 and H2 can be opened by complementary hybridization to initiate a self-assembly reaction and the signal can be re-amplified. The fluorescence probe was released after reaction and the high sensitivity and selectivity of detection of target DNA was achieved by two-step cyclic amplification technique. A novel immunosensor based on tyramine signal amplification is used to detect thrombin with high sensitivity. In this system, the magnetic microspheres are connected with gold nanoparticles by the specific binding of thrombin and two aptamers to form a composite structure of magnetic microspheres, thrombin and gold nanoparticles. At the same time, tyramine was combined with horseradish peroxidase (HRP) to form signal amplification. HRP-catalyzed substrates, hydrogen peroxide oxygen and p-hydroxyphenylacetic acid, were synthesized by the combination of tyramine and horseradish peroxidase (horseradish peroxidase). The sensitivity of tumor marker thrombin was detected by fluorescence signal detection.
【學(xué)位授予單位】：青島科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：O657.3

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本文編號：2193989