本文選題：2-甲基-3-甲氧基-4-苯基丁酸(MMPB) + 微囊藻毒素　； 參考：《江南大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：水體富營(yíng)養(yǎng)化(Eutrophication)致使藻類大量繁殖,引發(fā)藍(lán)藻水華在不同水域頻繁發(fā)生,導(dǎo)致自然生態(tài)系統(tǒng)失衡。微囊藻毒素(Microcystins,MCs)是由藍(lán)藻產(chǎn)生且具有強(qiáng)烈肝毒性、促癌性的代謝產(chǎn)物。MCs可通過多種途徑進(jìn)入生物體內(nèi),與生物體的肝臟、腎臟等器官作用導(dǎo)致生理病變,極大地危害了人類的健康和生態(tài)環(huán)境安全。因此,迫切需要一種先進(jìn)、可靠、快速、高效的方法測(cè)定不同環(huán)境中MCs的存在。事實(shí)上,研究報(bào)道MCs的種類已超過九十種以上。目前,國內(nèi)外利用色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)單種MC的研究很多,但由于受到標(biāo)準(zhǔn)品稀缺的制約,無法全面真實(shí)地反映藻毒素污染的水平。因此,建立一種靈敏度高、準(zhǔn)確性好的測(cè)定不同基質(zhì)中MCs總量的方法具有重要意義。Adda側(cè)鏈((2s,3s,8s,9s)-3-氨基-9-甲氧基-10-苯基-2,6,8-三甲基-10-苯基-4,6-二烯酸)是MCs的特征結(jié)構(gòu)。特定條件下,通過氧化MCs分子中Adda側(cè)鏈的共軛雙鍵,可生成名為2-甲基-3-甲氧基-4-苯基丁酸(MMPB)的化合物。因而,通過測(cè)定MMPB含量可以間接獲知不同環(huán)境基質(zhì)中MCs總量。文獻(xiàn)報(bào)道,多采用Lemieux oxidation法將MCs轉(zhuǎn)化為MMPB。但是,Lemieux oxidation法存在步驟復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。相反,臭氧具有極強(qiáng)的氧化性能,被譽(yù)為清潔、高效的氧化劑。此外,為了未來能夠從環(huán)境藻類樣品中進(jìn)行大規(guī)模地純化、制備MCs作為試驗(yàn)材料以進(jìn)行深入研究,還對(duì)從藍(lán)藻中提取、分離、凈化MCs的條件進(jìn)行探究和優(yōu)化。具體研究?jī)?nèi)容包括:(1)詳細(xì)探究利用臭氧氧化MCs生成MMPB的方法條件。同時(shí),優(yōu)化MMPB與氯甲酸甲酯(MCF)進(jìn)行甲酯化反應(yīng)的條件。結(jié)果表明,常溫酸性條件下(p H 3.0),臭氧可高效地定量氧化MCs,氧化產(chǎn)物MMPB與MCF在水相中快速反應(yīng),經(jīng)氯仿萃取后進(jìn)行氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS)分析。該方法在MCs濃度10~300μg L-1的范圍內(nèi),MMPB-OCH3和內(nèi)標(biāo)物4-PB-OCH3峰面積比值與MCs濃度之間具有良好的線性關(guān)系(R20.996),方法檢出限為0.34μg L-1(S/N=3)。樣品加標(biāo)回收率為77.7%~80.2%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1~6.5%。結(jié)果說明,該方法具有良好的回收率與重現(xiàn)性并可應(yīng)用于水體中MCs總量的分析。(2)對(duì)從藍(lán)藻中提取、分離、凈化MCs的條件進(jìn)行探究和優(yōu)化。同時(shí),還定性分析了藍(lán)藻中MCs的種類并利用MMPB法對(duì)其總量進(jìn)行測(cè)定。研究證明,室溫條件下,采用攪拌和超聲粉碎聯(lián)用方法,利用70%甲醇水溶液對(duì)藍(lán)藻樣品進(jìn)行提取可獲得良好效果。同時(shí),為了能夠去除藻膽蛋白的影響,利用等電點(diǎn)沉淀法將溶液p H值調(diào)節(jié)至4.0左右,使蛋白質(zhì)變性析出。隨后采用SPE柱對(duì)其進(jìn)一步富集純化,SPE的實(shí)驗(yàn)條件為:20%甲醇為淋洗劑,90%甲醇(含0.10%三氟乙酸)為洗脫劑。采用上述已優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件,對(duì)不同區(qū)域的藍(lán)藻樣品中MCs種類進(jìn)行定性分析。結(jié)果顯示,MCs種類與數(shù)量隨時(shí)間、地點(diǎn)不同進(jìn)行變更。MMPB法測(cè)定MCs總量的結(jié)果高于單種MC含量之和,說明藍(lán)藻樣品中可能存在未知MC種類,但由于缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品,無法全面準(zhǔn)確定性分析未知MCs的種類。然而,針對(duì)能夠準(zhǔn)確定性的MCs如MC-RR、MC-LR等,本研究的優(yōu)化方法可為其未來從環(huán)境藻類樣品中進(jìn)行大量制備奠定良好的基礎(chǔ)。(3)采用加速溶劑萃取(ASE)和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS)聯(lián)用技術(shù),建立了快速提取和測(cè)定水產(chǎn)品中毒性最強(qiáng)的兩種游離態(tài)藻毒素(MC-RR、MC-LR)含量的方法。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的篩選和優(yōu)化,確定ASE的優(yōu)化條件:85%甲醇水溶液為萃取劑,弗羅里硅土為吸附劑,萃取溫度85oC,靜態(tài)循環(huán)2次,最終萃取體積20 m L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,微囊藻毒素的質(zhì)量濃度在0.025~8μg/g范圍內(nèi),峰面積與其質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好(R20.997)。樣品加標(biāo)回收率為68.5~86.3%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.0%~9.8%。該研究適用于淡水水產(chǎn)品中游離態(tài)單種MC分析測(cè)定。因?yàn)樗a(chǎn)品體內(nèi)部分MCs與蛋白磷酸酶通過共價(jià)鍵結(jié)合后,采用常規(guī)的提取手段無法將其分離出來。另外,受到商品化MC標(biāo)準(zhǔn)品稀缺的限制,無法全面地檢測(cè)單種藻毒素的含量。為準(zhǔn)確、真實(shí)反映水產(chǎn)品中MCs的污染水平,研究通過MMPB法檢測(cè)水產(chǎn)品中MCs總量,采用固相萃取手段對(duì)MMPB進(jìn)行富集和凈化,甲酯化處理后進(jìn)行GC-MS分析。結(jié)果表明,MCs濃度在0.02~10μg/g范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(R20.995)。加標(biāo)回收率范圍為72~85%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.2~10.5%。實(shí)驗(yàn)證明,這種方法較好的滿足了水產(chǎn)品中MCs總量的分析要求。
[Abstract]:Water eutrophication (Eutrophication) causes a large number of algae to reproduce, causing cyanobacteria blooms frequently occurring in different waters, leading to the imbalance of natural ecosystems. Microcystins (MCs) is produced by cyanobacteria and has strong hepatotoxicity, and the carcinogenic metabolite.MCs can enter organisms through a variety of ways, and the liver of organisms. Organs such as dirty, kidney and other organs lead to physiological diseases, which greatly harm human health and ecological environment safety. Therefore, an advanced, reliable, rapid and efficient method for the determination of MCs in different environments is urgently needed. In fact, more than ninety kinds of MCs have been reported. There are many studies on the detection of single MC, but due to the shortage of standard products, it is impossible to fully reflect the level of algae toxin pollution. Therefore, it is of great significance to establish a high sensitivity and accurate method for the determination of the total amount of MCs in different substrates (2S, 3S, 8s, 9S) -3- amino -9- methoxy -10- phenyl -2,6,8- three methyl - 10- phenyl -4,6- two enoic acid) is a characteristic structure of MCs. Under specific conditions, a compound named 2- methyl -3- methoxy -4- phenyl butyric acid (MMPB) can be produced by oxidizing the conjugated double bonds of the Adda side chain of the MCs molecule. Thus, the MCs amount in different environmental bases can be indirectly known by the determination of MMPB content. The method transforms MCs into MMPB., but the Lemieux oxidation method has the disadvantages of complex steps and long time consuming. On the contrary, the ozone has very strong oxidation performance and is known as clean and efficient oxidizing agent. In addition, in order to be able to purify from the environmental algae samples in a large scale in the future, the MCs is prepared as a test material for in-depth study, and also from blue. The conditions of extraction, separation and purification of MCs are explored and optimized. The specific research contents include: (1) the conditions of using ozone to oxidize MCs to produce MMPB are discussed in detail. At the same time, the conditions for the methylene esterification of MMPB and methyl chloroformate (MCF) are optimized. The results show that ozone can efficiently oxidize MCs and oxygen at the ambient temperature acidity (P H 3). The product MMPB and MCF reacted rapidly in the water phase and analyzed by gas chromatography tandem mass spectrometry (GC-MS) after chloroform extraction. The method has a good linear relationship between the 4-PB-OCH3 peak area ratio of MMPB-OCH3 and the internal standard and the MCs concentration in the range of MCs concentration 10~300 uh g L-1 (R20.996). The detection limit is 0.34 mu g. The standard recovery rate is 77.7%~80.2%, and the relative standard deviation is 4.1~6.5%.. The method has good recovery and reproducibility and can be applied to the analysis of the total amount of MCs in water. (2) the conditions of extracting, separating and purifying MCs from cyanobacteria are explored and optimized. At the same time, the species of MCs in cyanobacteria are analyzed and MMPB method is used. The total amount is measured. It has been proved that, under the condition of room temperature, the extraction of cyanobacteria with 70% methanol solution can be obtained by mixing and ultrasonic comminution. At the same time, in order to remove the effect of alginin, the P H value of the solution is adjusted to about 4 by isoelectric point precipitation method, and then the protein denaturation can be precipitated. The SPE column was used to further enrich and purify it. The experimental conditions of SPE were 20% methanol as the eluent and 90% methanol (containing 0.10% three FLUOROACETIC acid) as eluant. The MCs species in the samples of cyanobacteria in different regions were qualitatively analyzed with the above optimized experimental conditions. The results showed that the variety and quantity of MCs changed with the time and place to change the.MMPB method. The results of the total MCs determination are higher than the sum of the single MC content, indicating that there may be unknown MC species in the cyanobacteria samples. However, due to the lack of corresponding standard products, the species of unknown MCs can not be comprehensively and accurately analyzed. However, the optimization method for the accurate qualitative MCs, such as MC-RR, MC-LR, etc., can be used for the future from the environmental algae samples. A good foundation is laid for a large number of preparation. (3) the rapid extraction and determination of the two most toxic free algae toxins (MC-RR, MC-LR) in aquatic products by accelerated solvent extraction (ASE) and super high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS) are established. Through screening and optimization of the experimental conditions, the advantages of ASE are determined. Conditions: 85% methanol water solution is an extractant and Florida siliceous soil is an adsorbent. The extraction temperature is 85oC, the static cycle is 2 times, the final extraction volume 20 m L. shows that the mass concentration of microcystin is in the range of 0.025~8 g/g, and the peak area has a good linear relationship with the mass concentration (R20.997). The recovery rate of the sample is 68.5~86.3%, and the ratio of the sample addition is 68.5~86.3%. The standard deviation is 7.0%~9.8%., which is suitable for the determination of isolated MC in the middle reaches of freshwater aquatic products. Because some of the MCs and protein phosphatase in the aquatic products are combined with the covalent bonds, they can not be separated by conventional methods. In addition, the limitation of the scarcity of commercialized MC standard products can not fully detect the single species of algae. In order to accurately reflect the pollution level of MCs in aquatic products, the total amount of MCs in aquatic products was detected by MMPB method. Solid phase extraction was used to enrich and purify the MMPB and GC-MS analysis after methyl esterification. The results showed that the MCs concentration had a good linear relationship (R20.995) in the range of 0.02~10 mu g/g. The rate range is 72~85% and the relative standard deviation is 8.2~10.5%.. Experiments show that this method can better meet the analysis requirements of MCs in aquatic products.
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：O657.63;TS254.7

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本文編號(hào)：1914148