本文選題：熒光素 + 類過氧化物酶活性　； 參考：《西南大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：天然酶,如辣根過氧化物酶(HRP),由于在溫和的條件下具有高的催化效率和特異性,已被廣泛應(yīng)用在各個領(lǐng)域,如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、生物傳感器、臨床診斷和有機(jī)合成等。但天然酶也存在一些固有缺陷,如大規(guī)模生產(chǎn)成本高、易受環(huán)境變化的影響而失活、變性,因此研究者一直致力于開發(fā)能克服上述缺陷的模擬酶。自從2007年閻錫蘊院士研究組首先報道Fe3O4磁性納米粒子具有類過氧化物酶活性以來,在過去的十年里,納米酶的構(gòu)建已經(jīng)成為研究熱點。與天然酶相比,這些納米酶具有更高的穩(wěn)定,對極端環(huán)境耐受性強(qiáng),成本低,易于制備、存儲和操作。但是它們大多數(shù)在水溶液中或高鹽條件下長時間放置易于團(tuán)聚而失去催化活性,因此必須引入表面修飾基團(tuán)增加納米酶在溶液中的穩(wěn)定性。然而這些穩(wěn)定劑往往會抑制其模擬酶的活性。另外,大部分的納米酶很難大批量的制備,而且同種納米酶的催化活性也存在批次間的差異。上述這不足嚴(yán)重制約了納米酶的應(yīng)用。因此,尋找能克服納米酶缺點的新型模擬酶意義重大。我們首次發(fā)現(xiàn),有機(jī)小分子物質(zhì)——熒光素具有過氧化物模擬酶和可見光誘導(dǎo)的氧化物模擬酶活性,并詳細(xì)研究了催化機(jī)理、基團(tuán)與其模擬酶活性之間的關(guān)系。基于熒光素的模擬酶活性,成功構(gòu)建了檢測H_2O_2、三磷酸腺苷(ATP)和羧酸酯酶(CaE)的光度分析新方法。具體內(nèi)容如下:(1)熒光素的過氧化物模擬酶活性研究我們首次報道了小分子物質(zhì)熒光素具有過氧化物模擬酶的活性,并用于定量檢測H_2O_2。熒光素能催化H_2O_2氧化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)發(fā)生顯色反應(yīng)。催化過程遵循典型的Michaelis-Menten動力學(xué)模型。電子自旋共振(ESR)實驗結(jié)果表明熒光素能催化H_2O_2分解產(chǎn)生·OH。與天然酶相比,在極端的條件下熒光素展現(xiàn)出更好的耐受性和穩(wěn)定性。熒光素的耐受性使它在生物醫(yī)學(xué)、工業(yè)和環(huán)境化學(xué)等領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用。我們的研究開啟了從有機(jī)小分子物質(zhì)中篩選模擬酶的新思路。(2)基團(tuán)對熒光素過氧化物模擬酶活性的影響熒光素作為一種新型的有機(jī)小分子模擬酶,其催化活性與結(jié)構(gòu)高度相關(guān)。我們系統(tǒng)比較了熒光素、羧基熒光素、氨基熒光素的過氧化物模擬酶活性、電子自旋共振譜(ESR)信號、酶動力學(xué)參數(shù)和表觀活化能,發(fā)現(xiàn)羧基可能為底物TMB的結(jié)合位點,能增強(qiáng)催化活性。而氨基卻抑制其催化反應(yīng)。這為設(shè)計和構(gòu)建其它有機(jī)小分子模擬酶奠定了基礎(chǔ)。(3)基于熒光素的過氧化物模擬酶活性比色檢測羧酸酯酶基于不同熒光素衍生物過氧化物模擬酶活性差異,我們構(gòu)建了一種檢測羧酸酯酶(CaE)的新方法:熒光素二乙酸酯(FDA)無過氧化物模擬酶活性,CaE可以催化FDA水解產(chǎn)生有過氧化物模擬酶活性的熒光素;生成的熒光素可以催化TMB-H_2O_2發(fā)生顯色反應(yīng)。652 nm處的吸光度可以用于CaE的定量檢測,線性范圍為5 U/L到5000 U/L,檢出限低至1.7 U/L。本方法也具有很好的選擇性,成功用于胎牛血清(FBS)中CaE活性分析。該研究提出了以有機(jī)小分子模擬酶為探針、基于模擬酶活性改變構(gòu)建分析方法的新思路。(4)熒光素作為過氧化物模擬酶用于ATP檢測本章基于ATP顯著抑制熒光素的過氧化物模擬酶活性,構(gòu)建了檢測ATP的新方法。由于ATP的磷酸基與熒光素的結(jié)合位點(即羧基)結(jié)合,降低了其催化H_2O_2氧化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)發(fā)生顯色反應(yīng)的能力,據(jù)此用于ATP的高靈敏檢測。該方法靈敏度高,檢測限低至3.2 n M,線性范圍寬(7.5n M-500 n M),成功應(yīng)用于胎牛血清(FBS)中ATP的檢測。該方法簡單靈敏,無需標(biāo)記和抗體等識別物質(zhì)。(5)熒光素的可見光誘導(dǎo)類氧化酶活性研究我們首次發(fā)現(xiàn)了熒光素的可見光誘導(dǎo)類氧化酶活性。在可見光照射下,熒光素能催化典型的顯色底物如3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、鄰苯二胺(OPD)和2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)氧化并使其發(fā)生顏色改變。其催化反應(yīng)遵循典型的Michaelis-Menten動力學(xué)模型,而且熒光素對底物TMB的親和力比HRP的大。我們闡明了熒光素的催化機(jī)理,證實在可見光照射下,O_2~(·-)和h+是熒光素催化TMB氧化過程中產(chǎn)生的主要活性物種。不需要容易分解的H_2O_2,熒光素以溶解氧作為一種溫和、綠色的電子受體,而且只需10分鐘可見光照射,就能獲得很高的催化活性。(6)基團(tuán)對氧雜蒽染料可見光誘導(dǎo)類氧化酶活性的影響作為一種最常用的氧雜蒽染料的熒光素被廣泛應(yīng)用在諸多領(lǐng)域。我們系統(tǒng)研究了具有相同結(jié)構(gòu)特征的11種典型氧雜蒽染料的光誘導(dǎo)類氧化酶活性并詳細(xì)探討了基團(tuán)對其光誘導(dǎo)模擬酶活性的影響。這11種染料包括熒光素(F)、8種熒光素衍生物,即羧基熒光素(CF)、氨基熒光素(AF)、鈣黃綠素(CC)、2’,7’-二氯熒光素(DCF)、氯化熒光素(FC)、熒光素二乙酸酯(FDA)、四碘熒光素(EB)、四溴熒光素(EY)和2種陽離子羅丹明衍生物,即羅丹明B(RhB)和羅丹明6G(Rh6G)。其中除了FDA和FC沒有可見光誘導(dǎo)的類氧化酶活性以外,其它9種氧雜蒽染料都有光催化活性。通過系統(tǒng)考察它們的吸收強(qiáng)度和酶動力學(xué)參數(shù),我們發(fā)現(xiàn)羧基能提高催化效率。氨基的存在會降低其催化活性。羧基和強(qiáng)吸電子基團(tuán)能增強(qiáng)與底物的親和能力。氨基和羧酸酯基會減弱與底物的親和能力。這為設(shè)計性能優(yōu)良的新型可見光誘導(dǎo)模擬酶奠定了基礎(chǔ)。(7)熒光素作為可見光誘導(dǎo)類氧化酶用于構(gòu)建羧酸酯酶比色檢測新方法羧酸酯酶(CaE)具有代謝藥物、解毒毒素和激活抗癌前藥等重要作用,而且血漿中的CaE可作為肝細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物,所以超靈敏和高選擇性檢測血清樣品中的CaE活性意義重大。本章利用熒光素的可見光誘導(dǎo)的類氧化酶活性,構(gòu)建了一種新型的羧酸酯酶比色檢測方法:以無光誘導(dǎo)模擬酶活性的FDA為探針,CaE可以催化FDA水解產(chǎn)生具有很強(qiáng)光誘導(dǎo)模擬酶活性的熒光素,以TMB為顯色底物,構(gòu)建檢測CaE的檢測平臺。該方法靈敏度高,檢出限低至0.013 U/L,優(yōu)于現(xiàn)有的光學(xué)分析方法;線性范圍較寬(0.04至20 U/L);成功應(yīng)用于胎牛血清(FBS)中CaE活性的檢測。
[Abstract]:Natural enzymes , such as horseradish peroxidase ( HRP ) , have been widely used in various fields such as enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ) , biosensor , clinical diagnosis and organic synthesis . This paper presents a new method for detecting ATP in fetal bovine serum ( FBS ) . The method is simple and sensitive , the detection limit is low to 3.2 n M , and the detection limit is low to 1.7 U / L . The method is simple and sensitive , the detection limit is low to 3 . 2 n M , the detection limit is low to 1.7 U / L .

【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：O657.3

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本文編號：1839758