本文選題：蛋白質(zhì)質(zhì)譜　切入點(diǎn)：微電泳　出處：《中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：常規(guī)的蛋白質(zhì)質(zhì)譜依賴于包括高效液相色譜和凝膠電泳在內(nèi)的其他技術(shù)對復(fù)雜體系中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。一方面,正是這些耗時(shí)、離線的分離純化過程嚴(yán)重改變了蛋白質(zhì)的生存環(huán)境,從而導(dǎo)致質(zhì)譜檢測到的蛋白質(zhì)并不一定是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的真實(shí)狀態(tài)。另一方面,這些樣品預(yù)處理過程可能會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)低豐度的蛋白質(zhì)等樣品信息丟失。這些蛋白質(zhì)卻可能在某些疾病甚至癌癥的發(fā)病過程中扮演著不可或缺的角色。而這是相當(dāng)危險(xiǎn)的,因?yàn)楹芏嗯R床診斷、醫(yī)學(xué)鑒定都是基于這些離線檢測結(jié)果。如果這些結(jié)果不可靠,就可能直接誤導(dǎo)醫(yī)生對疾病的診斷、治療方案的選擇等方面的判斷。綜上所述,開發(fā)能夠?qū)?xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行直接、快速分析的原位蛋白質(zhì)質(zhì)譜方法,無論是從基礎(chǔ)理論研究的角度還是生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的角度都很有意義。本博士研究課題就是旨在開發(fā)原位蛋白質(zhì)質(zhì)譜。這是一個(gè)全新的概念,核心目標(biāo)是揭示細(xì)胞內(nèi)真實(shí)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)相互作用。技術(shù)上,核心是利用毫秒級(jí)微電泳去除復(fù)雜體系中的干擾基質(zhì),還包括使用非變性質(zhì)譜和離子遷移質(zhì)譜等研究蛋白質(zhì)相互作用研究的常用手段。應(yīng)用上,本研究課題可以為蛋白質(zhì)科學(xué)提供可靠的基礎(chǔ)研究手段,同時(shí)在細(xì)胞水平上進(jìn)行抗癌靶向藥物的開發(fā)等方面也具有一定的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。主要分成如下三個(gè)部分開展相關(guān)的研究:1)集成連續(xù)超快電泳技術(shù),開發(fā)原位蛋白質(zhì)質(zhì)譜平臺(tái)。第一部分介紹如何擬集成連續(xù)超快電泳技術(shù),開發(fā)原位蛋白質(zhì)質(zhì)譜平臺(tái)。搭建超快電泳平臺(tái),實(shí)現(xiàn)毫秒量級(jí)微電泳分離行為:a)搭建直流單脈沖高壓電源,實(shí)現(xiàn)1赫茲左右的微電泳分離,b)搭建可控連續(xù)脈沖電源,實(shí)現(xiàn)幾赫茲至幾千赫茲連續(xù)可調(diào)的微電泳行為。通過快速電泳,可在毫秒量級(jí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中的干擾物與目標(biāo)化合物的初步分離,從而為后續(xù)電噴霧降低基質(zhì)效應(yīng)。利用高濃度生理鹽水等體系來模擬復(fù)雜基質(zhì),通過對模擬復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)化合物的檢測效果,來評價(jià)其分離能力并研究快速電泳的分離機(jī)理。因此,我們設(shè)計(jì)了毛細(xì)管電泳-電噴霧質(zhì)譜接口、常規(guī)尺寸下電噴霧中的離子抑制的緩解以及納升電噴霧中的離子抑制緩解等幾個(gè)方面的實(shí)驗(yàn)。2)原位蛋白質(zhì)質(zhì)譜用于蛋白質(zhì)分析。本部分主要介紹如何用我們開發(fā)的原位蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)對蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和功能研究。分成如下兩部分內(nèi)容:純?nèi)芤褐械牡鞍踪|(zhì)鑒定分析和復(fù)雜體系中的蛋白質(zhì)鑒定分析。純?nèi)芤褐?我們進(jìn)行了一系列的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)的研究,包括用原位蛋白質(zhì)質(zhì)譜對雙硫鍵蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測序,以及開發(fā)單域蛋白質(zhì)的折疊結(jié)構(gòu)的可調(diào)、梯度地打開新方法,以探究蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。復(fù)雜體系中的蛋白質(zhì)鑒定分析,則分別展示了如何用原位蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)在高鹽條件下、胎牛血清中、細(xì)胞裂解液以及完整活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白質(zhì)的定性、定量分析。3)原位蛋白質(zhì)質(zhì)譜用于蛋白質(zhì)相互作用分析。這部分我們將介紹原位蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用。主要包含蛋白質(zhì)-金屬離子相互作用和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等幾個(gè)方面。我們的主要蛋白質(zhì)模型包括鋅指蛋白(NCp7,Sp1等)、鈣調(diào)蛋白(Calmodulin,CaM)和血紅蛋白等。實(shí)驗(yàn)場合從純?nèi)芤旱郊?xì)胞內(nèi)的原位分析,主要技術(shù)難點(diǎn)在于實(shí)現(xiàn)對完整活細(xì)胞的原位蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析。這種方法避免了復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境造成的干擾問題。以這種方式,我們展示了如何從大腸桿菌細(xì)胞快速鑒定完整的蛋白質(zhì),包括鈣離子與鈣調(diào)蛋白的絡(luò)合。后者表現(xiàn)出與體外實(shí)驗(yàn)不同的結(jié)合狀態(tài)。這些結(jié)果表明,在體外測量的結(jié)果并不一定可以用來代替在活細(xì)胞內(nèi)的實(shí)際情況。這可能也是很多抗癌藥物在體外實(shí)驗(yàn)效果良好,但是一旦進(jìn)入體內(nèi)或者復(fù)雜的腫瘤環(huán)境中就失效的原因之一。
[Abstract]:Other conventional techniques rely on protein mass spectrometry including high-performance liquid chromatography and gel electrophoresis, the protein in the complex system of separation and purification. On the one hand, it is the time-consuming purification process seriously changed the living environment of the off-line protein separation, resulting in mass spectrometry detected protein is not necessarily intracellular protein true. On the other hand, the sample pre process may directly lead to intracellular low abundance protein samples. The loss of information plays an indispensable role in the pathogenesis of these proteins may in some diseases and even cancer. And this is very dangerous, because a lot of clinical diagnosis, medical evaluation of all these offline based on the test results. If these results are not reliable, may directly lead doctors to diagnosis, treatment options and judgment 鏂，

本文編號(hào)：1609517