本文關鍵詞： 電化學發(fā)光 羥甲基化DNA 胸腺嘧啶DNA糖苷酶 納米材料 核酸信號放大　出處：《西北大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：在哺乳動物基因組DNA中,最新發(fā)現(xiàn)的5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hmC)被稱為繼5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)之后的“第六種堿基”,是一種新的表觀遺傳修飾物。5-hmC存在于人和小鼠腦組織以及小鼠的胚胎干細胞中,通過TET(ten-eleven translocation)酶氧化 5-mC 產(chǎn)生。研究表明,5-hmC 不僅參與了 DNA 主動去甲基化、體細胞重新編程和胚胎發(fā)育等重要的生物過程,也與多種疾病有關,如癌癥,它在多種癌細胞中含量的降低使其有可能成為癌癥早期診斷的標志物。胸腺嘧啶DNA糖苷酶(TDG)是一種堿基切除修復酶,它可特異性識別并移除5-mC、5-hmC去氨基后的產(chǎn)物以及5-hmC連續(xù)氧化的產(chǎn)物,引發(fā)堿基切除修復通路(BER)完成堿基的正常配對,在DNA去甲基化過程中也扮演了重要的表觀遺傳角色。因此,建立高靈敏檢測羥甲基化DNA(5-hmC-DNA)和TDG活性的方法對于DNA去甲基化機理的研究和癌癥早期的診斷具有重要的意義。相比已報道的檢測羥甲基化DNA和TDG活性方法,電化學發(fā)光法因具有電化學方法和化學發(fā)光法的雙重優(yōu)勢,如靈敏度高、反應可控性好、響應速度快、易于微型化等優(yōu)點而備受關注。基于此,本文建立了兩種高靈敏檢測羥甲基化DNA和TDG活性的電化學發(fā)光生物傳感新方法。全文共分為三章,主要內(nèi)容如下:第一章,緒論。首先,概述了電化學發(fā)光的定義和特點;其次,綜述了核酸信號放大和納米材料信號放大策略與應用;最后,提出了本論文的研究內(nèi)容和意義。第二章,基于T4噬菌體β-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(T4β-glycosyltransferase,β-GT)在葡萄糖供體尿核苷二磷酸葡萄糖(UridineDiphosphoglucose,UDP-Glu)存在的情況下,特異性的糖基化 5-hmC 形成 β-葡萄糖基-5-羥甲基胞嘧啶(β-glucosyl-5-hydroxyme-thylcytosine,5-ghmC),利用氧化石墨烯(GO)負載多個信號分子進行信號放大,構建了一種高選擇性、高靈敏的新型電化學發(fā)光生物傳感器,用于羥甲基化DNA的檢測。結果表明,在優(yōu)化條件下,該傳感器檢測羥甲基化DNA的線性范圍為0.01 pM～1.00 nM,檢出限為3.84 fM。第三章,基于生物條形碼(bio-barcode)引發(fā)雜交鏈式反應(HCR)進行無酶雙重信號放大,結合電化學發(fā)光信號物質(zhì)鄰菲Up啉釕(Ru(phen)32+)能高效、穩(wěn)定地嵌入DNA雙螺旋結構的特點,構建了一種高靈敏的新型電化學發(fā)光生物傳感器,用于TDG活性的分析。結果表明,在優(yōu)化條件下,該傳感器檢測TDG的線性范圍為5×10-5U/μL～1×10-2U/μL,檢出限為 1.1×10-5U/μL(0.0028ng/mL)。
[Abstract]:In mammalian genomic DNA, The newly discovered 5-hydroxymethylcytosine 5-hydroxycytosine (5-HMC) is known as "6th bases" after 5-methylcytosine (5-methylcytosine). It is a new epigenetic modifier. 5-hmC is present in human and mouse brain tissues and embryonic stem cells in mice. TET(ten-eleven translocation enzymes oxidize 5-mC production. Studies have shown that 5-HMC is involved not only in the active demethylation of DNA, somatic cell reprogramming and embryo development, but also in many diseases, such as cancer. Its reduced levels in a variety of cancer cells make it possible to become a marker for early cancer diagnosis. Thymine DNA glycosidase is a base excision repair enzyme. It can specifically recognize and remove the product of 5-hmC deaminination and 5-hmC continuous oxidation, and trigger the base excision repair pathway (ber) to complete the normal pairing of the base, which also plays an important epigenetic role in the process of DNA demethylation. The establishment of a highly sensitive method for the detection of hydroxymethylated DNA-5-hmC-DNA and TDG activity is of great significance for the study of the mechanism of DNA demethylation and the early diagnosis of cancer, compared with the reported methods for the detection of hydroxymethylated DNA and TDG activities. Electrochemiluminescence (ECL) has attracted much attention for its advantages of both electrochemical and chemiluminescence methods, such as high sensitivity, good controllability, fast response and easy miniaturization. In this paper, two novel electrochemiluminescence biosensors with high sensitivity for the detection of hydroxymethylated DNA and TDG activities have been developed. The main contents are as follows: chapter 1, introduction. Firstly, the definition and characteristics of ECL are summarized. Secondly, the strategies and applications of nucleic acid signal amplification and nanomaterial signal amplification are reviewed. Based on T4 phage 尾 -glycosyltransferase (尾 -GT) in the presence of glucose donor Uridine Diphosphoglucose (UDP-Glu), A novel electrochemiluminescence biosensor with high selectivity and high sensitivity was constructed by the specific glycosylation of 5-hmC to form 尾 -glucosyl-5-hydroxythylcytosine (5-hydroxythylcytosine) -loaded with several signal molecules for signal amplification. The results show that under the optimized conditions, the linear range of the sensor for detection of hydroxymethylated DNA is 0. 01 pM~1.00 / nM. the detection limit is 3. 84 fM. Chapter 3, Based on the bio-barcode-based hybrid chain reaction (DNA), the enzyme free double signal amplification combined with the electrochemical luminescent signal substance, o-phenanthroline ruthenium Rufen 32) can efficiently and stably embed the DNA double helix structure. A novel electrochemiluminescence biosensor with high sensitivity was constructed for the analysis of TDG activity. The results show that the linear range of the biosensor for detecting TDG is 5 脳 10 ~ (-5) U / 渭 L ~ (-1) 脳 10 ~ (-2) U / 渭 L, and the detection limit is 1.1 脳 10 ~ (-5) U / 渭 L ~ (0.0028) ng / m ~ (-1).
【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q52;O657.1

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