發(fā)布時(shí)間：2017-12-18 05:34

  本文關(guān)鍵詞：基于核酸適配體構(gòu)象變化的抗生素電化學(xué)傳感器研究

  更多相關(guān)文章： 核酸適配體 抗生素檢測(cè) 電化學(xué)傳感器

【摘要】：抗生素作為一種微生物的代謝產(chǎn)物,具有殺死或抑制微生物生長(zhǎng)的作用。近年來(lái)作為抗菌藥物被廣泛應(yīng)用于治療各種非病毒感染疾病,尤其是在畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛�？股氐倪^(guò)量和不正當(dāng)使用導(dǎo)致了它在食物中的殘留量逐年增加。人們長(zhǎng)期食用含有抗生素殘留的食物會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)抗生素的富集,使人體對(duì)抗生素產(chǎn)生抗藥性,同時(shí)也誘導(dǎo)產(chǎn)生了超級(jí)細(xì)菌。近年來(lái)食物中抗生素殘留問(wèn)題受到世界各國(guó)的極大關(guān)注,很多國(guó)家也制定了一系列有關(guān)食物中抗生素的最大殘留量指標(biāo)。但是現(xiàn)存檢測(cè)抗生素的傳統(tǒng)方法均受到各種內(nèi)在外在條件的限制。因此,迫切需要研究一種高靈敏性、高選擇性的檢測(cè)食物中抗生素殘留量的方法。本文利用電化學(xué)傳感手段結(jié)合核酸適配體的構(gòu)象變化構(gòu)建了檢測(cè)食品中抗生素殘留量的生物傳感器。構(gòu)建的傳感器對(duì)待測(cè)目標(biāo)物均表現(xiàn)出較低的檢測(cè)限和較寬的線性范圍,并有良好的選擇性和穩(wěn)定性,在實(shí)際樣品的檢測(cè)中也得到了較好的回收率。本論文主要進(jìn)行了以下幾方面研究:1.通過(guò)在修飾了納米金/石墨烯-殼聚糖復(fù)合物的玻碳電極上自組裝巰基化的孔雀石綠適配體來(lái)構(gòu)建一個(gè)基于電化學(xué)傳感體系的RNA適體傳感器來(lái)靈敏、特異得檢測(cè)孔雀石綠的電化學(xué)傳感器。電極構(gòu)建完成后,先將烷硫醇固定在納米金表面來(lái)形成統(tǒng)一的修飾,并減少非特異性吸附。然后將修飾好的電極在含有孔雀石綠的體系中孵育,目標(biāo)物孔雀石綠可以誘導(dǎo)其適配體發(fā)生構(gòu)象變化,并特異性的結(jié)合孔雀石綠,從而將目標(biāo)分子固定在電極表面。然后再將標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶的孔雀石綠抗體修飾到電極上,由于抗原抗體之間的特異性識(shí)別作用,將辣根過(guò)氧化物酶固定在電極表面。最后通過(guò)讀取辣根過(guò)氧化物酶催化的過(guò)氧化氫的電還原信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)孔雀石綠的定量檢測(cè)。結(jié)果顯示,構(gòu)建的傳感器對(duì)孔雀石綠具有較低的檢測(cè)限:16.3 pg mL-1和寬的線性范圍:1×10-4-10μg mL-1。因此,基于RNA適配體構(gòu)建的電化學(xué)檢測(cè)策略能夠簡(jiǎn)單、快速、便宜、高靈敏和高特異性的定量檢測(cè)孔雀石綠。2.在這項(xiàng)工作中,基于目標(biāo)物與適配體雜交誘導(dǎo)的二次循環(huán)放大技術(shù),構(gòu)建了一種用于超靈敏和高選擇性的檢測(cè)抗生素的簡(jiǎn)單、快速、低成本的電化學(xué)生物傳感器。巧妙設(shè)計(jì)的發(fā)夾探針由目標(biāo)抗生素的適配體、內(nèi)切酶識(shí)別序列和互補(bǔ)雜交序列組成。有檢測(cè)目標(biāo)物存在時(shí),目標(biāo)物會(huì)與發(fā)夾探針上的適配體雜交,誘導(dǎo)發(fā)夾構(gòu)象發(fā)生變化,暴露出來(lái)的單鏈末端會(huì)捕獲均相中游離的信標(biāo)探針,以固定的信標(biāo)探針為引物,發(fā)生鏈延伸反應(yīng),生成完全互補(bǔ)的雙鏈結(jié)構(gòu)并把目標(biāo)物游離出來(lái),循環(huán)利用。生成的雙鏈中含有內(nèi)切酶的識(shí)別序列,在內(nèi)切酶與聚合酶的共同作用下,會(huì)產(chǎn)生成百上千的單鏈。產(chǎn)生的單鏈可以消耗溶液中的信標(biāo)探針導(dǎo)致電化學(xué)信號(hào)降低,從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的定量檢測(cè)。據(jù)我們所知,這項(xiàng)工作是第一次將基于目標(biāo)物與適配體雜交誘導(dǎo)的二次循環(huán)放大技術(shù)用于電化學(xué)分析檢測(cè)抗生素。在最佳條件下,所構(gòu)建的生物傳感器具有超寬的檢測(cè)范圍5 pM-10nM和極低的檢測(cè)限1.09 pM。此外,本研究的生物傳感器也顯示對(duì)目標(biāo)物氨芐青霉素具有高選擇性,并具有檢測(cè)速度快、成本低,操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。因此,基于目標(biāo)物與適配體雜交誘導(dǎo)的二次循環(huán)放大技術(shù)用于檢測(cè)氨芐青霉素的電化學(xué)方法具有用于實(shí)際中相關(guān)食品安全分析和臨床診斷的潛力。3.基于多重循環(huán)放大技術(shù)構(gòu)建了一種超靈敏檢測(cè)抗生素的電化學(xué)DNA傳感器。該多重循環(huán)放大包括聚合酶輔助的目標(biāo)物循環(huán)放大和核酸外切酶輔助的二級(jí)目標(biāo)物循環(huán)放大。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,巧妙設(shè)計(jì)的發(fā)夾探針會(huì)被目標(biāo)物與適配體之間的特異性雜交打開(kāi),并引發(fā)聚合酶誘導(dǎo)的目標(biāo)物循環(huán)放大反應(yīng),產(chǎn)生成千上萬(wàn)的二級(jí)目標(biāo)物。值得注意的是,產(chǎn)生的二級(jí)目標(biāo)物不僅能夠與剩下的發(fā)夾探針發(fā)生反應(yīng),也能置換下電極上的輔助探針。使亞甲基藍(lán)標(biāo)記的發(fā)夾探針自身折疊形成穩(wěn)定的發(fā)夾構(gòu)象,并獲得較高的電化學(xué)還原峰。經(jīng)過(guò)多重的信號(hào)放大技術(shù)構(gòu)建的傳感器可以超靈敏的檢測(cè)目標(biāo)抗生素,其最低檢測(cè)限可達(dá)1.3 fM。據(jù)我們所知,這項(xiàng)工作首次將多重循環(huán)放大與正信號(hào)的傳感策略結(jié)合用來(lái)定量檢測(cè)抗生素。該策略也可進(jìn)一步結(jié)合更多的分析手段來(lái)檢測(cè)更多的目標(biāo)物,所以該傳感手段具有構(gòu)建超靈敏的生物傳感平臺(tái)進(jìn)行生物分析,疾病診斷和臨床藥物的潛力。
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：O657.1;TP212

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 李秀銀;王月兵;李明川;;抗生素的分類及治療原則[J];臨床合理用藥雜志;2012年28期

2 李偉明;鮑艷宇;周啟星;;四環(huán)素類抗生素降解途徑及其主要降解產(chǎn)物研究進(jìn)展[J];應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào);2012年08期

3 張彩紅;索寶;李正洪;李兆林;陳麗娜;;原料奶中抗生素殘留及快速檢測(cè)方法[J];當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè);2012年07期

4 聶成霞;;生物傳感技術(shù)及傳感器在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J];肉類研究;2010年12期

5 嚴(yán)智燕;周立群;;生物傳感器在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用[J];農(nóng)藥研究與應(yīng)用;2010年03期

6 楊海朋;陳仕國(guó);李春輝;陳東成;戈早川;;納米電化學(xué)生物傳感器[J];化學(xué)進(jìn)展;2009年01期

7 侯亞莉;朱奎;丁雙陽(yáng);;牛奶中抗生素殘留檢測(cè)技術(shù)[J];中國(guó)乳業(yè);2008年06期

8 于見(jiàn)亮;李開(kāi)雄;賀家亮;鄧艷;;牛乳中抗生素的殘留及其控制對(duì)策[J];中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng);2006年10期

，

本文編號(hào)：1303036