本文關(guān)鍵詞：木質(zhì)纖維素降解酶不同結(jié)構(gòu)域結(jié)合纖維素能力的定量分析

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【摘要】：將玉米秸稈和小麥秸稈這樣的農(nóng)作物秸稈類生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化為生物燃料和化學(xué)制品,既能減輕秸稈焚燒造成的環(huán)境污染,又能增加農(nóng)民收入。當(dāng)前秸稈資源化不能大規(guī)模推廣實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的瓶頸在于纖維素酶的價(jià)格昂貴,并且催化效率不高。酶對(duì)底物的催化降解包括結(jié)合和斷鍵兩個(gè)過程。酶對(duì)底物的識(shí)別和結(jié)合是催化斷鍵的前提和基礎(chǔ),也是限速步驟。所以結(jié)合力大是酶活力高的前提和基礎(chǔ)。酶與底物的結(jié)合是個(gè)物理學(xué)過程,不涉及化學(xué)鍵的斷裂,結(jié)合形成的酶-底物(ES)復(fù)合體是瞬態(tài),不穩(wěn)定,這些因素使得結(jié)合力的測(cè)定非常困難。本文主要優(yōu)化了現(xiàn)有的測(cè)定糖苷水解酶對(duì)底物結(jié)合力的高通量表征平臺(tái),并對(duì)現(xiàn)有的結(jié)合力測(cè)定方法進(jìn)行了比較和分析,一定程度上提高了結(jié)合力測(cè)定的高通量和精準(zhǔn)度。在研究中選取了三種具有代表性的纖維素酶結(jié)構(gòu)域,通過三種不同的方法測(cè)定了纖維素酶分子中各結(jié)構(gòu)域與底物的結(jié)合力,為進(jìn)一步理解纖維素酶各結(jié)構(gòu)域?qū)Φ孜锝Y(jié)合過程的不同貢獻(xiàn)指明了方向。本論文的研究工作及主要成果如下：1.優(yōu)化了現(xiàn)有的糖苷水解酶結(jié)合力電泳(Binding電泳)技術(shù),結(jié)合圖像處理和定量分析,可以定量表征糖苷水解酶對(duì)底物的結(jié)合力,為高通量快速表征糖苷水解酶的結(jié)合力奠定了基礎(chǔ)。Binding電泳以活性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)為基礎(chǔ),在配制聚丙烯酰胺凝膠時(shí)往膠內(nèi)加入梯度濃度的底物CMC,在電泳過程中酶與底物不斷地結(jié)合和分離,電泳完成后通過Quantity One軟件對(duì)電泳條帶的相對(duì)遷移率進(jìn)行提取,并與CMC的濃度進(jìn)行線性回歸,線性擬合的R2值都在0.9以上表明電泳條帶的相對(duì)遷移率與CMC的濃度具有線性相關(guān)性。通過比較多種糖苷水解酶條帶相對(duì)遷移率隨CMC濃度增加的變化程度,可以快速分析和比較不同酶與底物的結(jié)合力。本文建立的糖苷水解酶結(jié)合力定量表征技術(shù),不僅可以定性分析有催化能力的糖苷水解酶的活性,與底物反浸的方法相結(jié)合定量分析酶活力,還可以定量表征糖苷水解酶對(duì)底物的結(jié)合力。該方法以活性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)為基礎(chǔ),所以樣品的需要量少,可以用于木質(zhì)纖維素降解酶理性改造后的快速篩選過程,因此該技術(shù)具有重要的應(yīng)用價(jià)值和實(shí)踐意義。2.對(duì)現(xiàn)有的普遍應(yīng)用的三種結(jié)合力測(cè)定方法進(jìn)行了系統(tǒng)地分析和比較,確定了三種方法的適用范圍,為研究蛋白質(zhì)與碳水化合物之間結(jié)合力的測(cè)定提供了方法上的指導(dǎo)。本文以測(cè)定結(jié)合力最為常用的精確度較高的方法——等溫滴定量熱法(ITC)為切入點(diǎn),通過對(duì)三種有代表性的纖維素酶結(jié)構(gòu)域及其突變體與底物的結(jié)合力進(jìn)行測(cè)定,探討了ITC方法測(cè)定結(jié)合力的優(yōu)缺點(diǎn)。ITC通過測(cè)定結(jié)合過程中的熱量變化,就能夠準(zhǔn)確計(jì)算結(jié)合常數(shù)(Ka)、焓變(ΔH)和熵變(AS),是現(xiàn)在唯一一種能夠在單次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)獲得酶與底物結(jié)合的所有參數(shù)的技術(shù)。ITC測(cè)定的是生物大分子在自然狀態(tài)下的親和力,不需要進(jìn)行修飾。但是利用ITC法進(jìn)行測(cè)定,需要進(jìn)行多次預(yù)實(shí)驗(yàn)來探索最合適的實(shí)驗(yàn)條件(例如：最適的酶濃度、最適底物濃度等),所以對(duì)底物和酶的需求量大,而且滴定過程耗時(shí),不能實(shí)現(xiàn)高通量。為了彌補(bǔ)ITC方法的不足,我們建立了結(jié)合力電泳(Binding電泳)技術(shù)。Binding電泳技術(shù)快速、高通量、靈敏度高、不需要進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)實(shí)驗(yàn),需要的樣品量少。只是精確度不如ITC,可以作為使用ITC前的一個(gè)普篩工具。研究結(jié)果顯示,由于碳水化合物結(jié)合模塊與底物的結(jié)合力低,Binding電泳法和ITC法的靈敏度都不能很好地檢測(cè)其結(jié)合力,而熒光光譜的方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)其較好地檢測(cè)。熒光光譜的方法是利用酶分子活性中心色氨酸殘基與碳水化合物結(jié)合導(dǎo)致熒光光譜的變化來進(jìn)行結(jié)合力的測(cè)定。此方法靈敏度高于ITC,而且操作簡單、耗時(shí)少、不需要復(fù)雜的預(yù)實(shí)驗(yàn)。但是熒光光譜的方法是用有效淬滅常數(shù)來表征結(jié)合力,不能求出像焓變、熵變這樣的熱力學(xué)常數(shù),所以更適合用于不同酶或者突變體與底物結(jié)合力的比較。3.通過對(duì)纖維素酶三種有代表性的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并用三種方法對(duì)各結(jié)構(gòu)域與底物進(jìn)行結(jié)合力的測(cè)定,闡明了各結(jié)構(gòu)域?qū)w維素酶與底物結(jié)合過程中的貢獻(xiàn)。選取三個(gè)有代表性的家族：GH12家族、CBM4家族和CBM1家族為研究對(duì)象,通過生物信息學(xué)分析,構(gòu)建了CBM1和CBM4家族的系統(tǒng)發(fā)育樹,分別分析了三個(gè)家族具有的酶活種類,反應(yīng)了三個(gè)家族酶的多功能性。通過對(duì)三個(gè)家族的活性架構(gòu)功能區(qū)和表面電勢(shì)進(jìn)行分析,說明了各家族的底物識(shí)別和定位機(jī)制；構(gòu)建了CBM4家族和GH12家族的活性中心序列譜,以及CBMI家族的全序列譜,分析了各家族與底物結(jié)合的關(guān)鍵性亞位點(diǎn),并分析了其中氨基酸的保守性。從活性架構(gòu)中能夠快速篩選對(duì)結(jié)合或者催化起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基,為后續(xù)的研究做準(zhǔn)備。本文通過對(duì)三種代表性的纖維素酶結(jié)構(gòu)域與底物結(jié)合力的測(cè)定得知,CBM1是由三個(gè)芳香族氨基酸形成的平面結(jié)合到結(jié)晶纖維素表面,其結(jié)合力要小于結(jié)合單根糖鏈的凹槽結(jié)合型的CBM4。對(duì)于同是凹槽結(jié)合類型的CBM4和GH12家族的EGⅢ, EGⅢ對(duì)CMC的結(jié)合力是CBM4對(duì)CMC結(jié)合力的10倍左右,結(jié)合活性中心序列譜分析可知,距離底物5A范圍內(nèi),氫鍵(由極性氨基酸與底物形成)和π-H作用(由芳香族氨基酸與底物形成)在EGIII中都遠(yuǎn)多于CBM4�？傊�,我們分析和比較了三種檢測(cè)結(jié)合力的方法,建立了一種快速高通量表征糖昔水解酶結(jié)合力的Binding電泳的方法,為闡明纖維素酶結(jié)合和催化機(jī)制、纖維素酶的理性設(shè)計(jì)和改造及優(yōu)良突變體的快速選擇提供了方法和技術(shù)上的支持。本文以纖維素酶家族和不同結(jié)構(gòu)域?yàn)檠芯繉?duì)象,建立了一種以纖維素酶家族為單位,通過對(duì)整個(gè)家族活性架構(gòu)的研究快速定位其功能決定性氨基酸的方法,通過對(duì)不同結(jié)構(gòu)域結(jié)合底物能力的研究,為糖苷水解酶不同結(jié)構(gòu)域重組形成重組酶以適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)提供了新思路。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：O629.8

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本文編號(hào)：1290755