本文關(guān)鍵詞：殼聚糖誘導(dǎo)下淺玫瑰色鏈霉菌差異蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究

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【摘要】：當(dāng)外界環(huán)境改變時(shí),微生物能改變自身的生理活動(dòng)以適應(yīng)壞境,其代謝活動(dòng)相關(guān)蛋白質(zhì)也會(huì)相應(yīng)變化。淺玫瑰色鏈霉菌(Streptomyces roseolus DH)是從東海附近土壤中篩選獲得的,能以葡萄糖或殼聚糖為唯一碳源,通過不同的代謝和調(diào)控機(jī)制生長(zhǎng),且在此過程中能產(chǎn)生相關(guān)的分解酶,如殼聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等,殼聚糖酶(由菌株獲得的)是一種內(nèi)切型酶,對(duì)殼聚糖具有分解作用的專一性酶,可以特異性的水解殼聚糖,得到的降解產(chǎn)物殼寡糖具有良好的水溶性且無毒、無熱源、無變異性,并具有抗癌、抑菌等生理活性,在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用廣泛。目前對(duì)殼聚糖誘導(dǎo)S.roseolus的研究側(cè)重于殼聚糖分解酶的分離、鑒定和優(yōu)化分解酶的發(fā)酵工藝等方面,而對(duì)該菌株利用殼聚糖的代謝機(jī)制缺乏了解,工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖分解酶尚存不足。本文首次對(duì)殼聚糖誘導(dǎo)S.roseolus的蛋白組學(xué)做了初步研究:(1)從純化菌體全蛋白的方法、上樣量、膠條的分離范圍和染色方法等方面對(duì)S.roseolus菌體全蛋白雙向電泳條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了一套適用于分析其差異表達(dá)蛋白的雙向電泳技術(shù),即以裂解液[7mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(w/v)CHAPS,2%(v/v)IPG緩沖液、40mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)和0.5%(v/v)蛋白酶抑制劑]結(jié)合超聲破碎細(xì)胞的方法提取菌體全蛋白,使用2D clean-up試劑盒純化提取的粗蛋白,去除雜質(zhì)對(duì)等電聚焦電泳的影響,選擇分離范圍為pH4-7的IPG膠條和80μg的上樣量進(jìn)行等電聚焦電泳,第一向電泳結(jié)束后,轉(zhuǎn)移膠條至SDS-PAGE(凝膠濃度為12%)上進(jìn)行垂直電泳。最后對(duì)凝膠進(jìn)行銀染法染色,獲得了低背景、高分辨率、適合差異蛋白分析的電泳圖譜。對(duì)S.roseolus菌體全蛋白進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn),利用lmageMaster2D Platinum7.0軟件對(duì)這三次實(shí)驗(yàn)圖譜進(jìn)行分析,重復(fù)率為89.4%,表明雙向電泳技術(shù)經(jīng)優(yōu)化后具有較高的生物學(xué)重復(fù),能被用于分析S.roseolus菌體蛋白。(2)利用已建立的雙向電泳技術(shù),對(duì)未誘導(dǎo)和殼聚糖誘導(dǎo)條件下菌體全蛋白進(jìn)行分離分析,并通過軟件對(duì)電泳圖譜分析,結(jié)果顯示:在未誘導(dǎo)條件下的S.roseolus總蛋白圖譜上可檢測(cè)到697±25個(gè)清晰可供分析的蛋白點(diǎn);殼聚糖誘導(dǎo)下的菌體總蛋白圖譜上可檢測(cè)到723±14個(gè)蛋白點(diǎn),選取10個(gè)在誘導(dǎo)菌株中差異表達(dá)量在5倍以上的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,并通過Swiss Prot2015、Uni Prot以及DAVID等對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):延伸因子G、烯醇化酶等蛋白表達(dá)量增加。這些蛋白在蛋白合成、糖代謝以及應(yīng)激反應(yīng)過程中起重要作用,表明在殼聚糖的誘導(dǎo)下,S.roseolus發(fā)生應(yīng)激反應(yīng),生成可分解利用殼聚糖的有關(guān)蛋白,促使與蛋白合成有關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)量增大。此外,殼聚糖在菌體內(nèi)被降解后,降解產(chǎn)物的吸收利用需要通過糖酵解、三羧酸循環(huán)等一系列代謝活動(dòng),這導(dǎo)致與這些代謝活動(dòng)有關(guān)蛋白的表達(dá)量也明顯增加,在殼聚糖培養(yǎng)的條件下這些表達(dá)差異蛋白維持了S.roseolus的正常生理活動(dòng)。(3)利用種子液和殼聚糖發(fā)酵培養(yǎng)基分別培養(yǎng)S.roseolus,收集上清液進(jìn)行雙向電泳。通過比較三種胞外蛋白純化方法的效果后,選擇TCA-丙酮法進(jìn)行后續(xù)胞外蛋白的雙向電泳分析,利用已建立的雙向電泳技術(shù),獲得未誘導(dǎo)和殼聚糖誘導(dǎo)條件下胞外蛋白電泳圖譜并用軟件對(duì)其進(jìn)行分析,在未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)條件下的圖譜上分別檢測(cè)到391±13和427±10個(gè)蛋白點(diǎn),經(jīng)匹配和差異分析發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)菌株中有15個(gè)蛋白的表達(dá)量有顯著差異,其中13個(gè)蛋白上調(diào),2個(gè)蛋白下調(diào),選取10個(gè)差異表達(dá)量在5倍以上的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,成功鑒定出7個(gè)有效蛋白,通過SwissProt2015、Uni Prot以及DAVID等對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):核糖體30S亞基蛋白S13、延伸因子Ts、和蘋果酸脫氫酶等蛋白豐度增加,這與殼聚糖誘導(dǎo)下S.roseolus全蛋白差異表達(dá)結(jié)果一致。本研究獲得了有關(guān)殼聚糖代謝的蛋白信息,為揭示S.roseolus代謝殼聚糖的途徑提供生物學(xué)信息,也為其產(chǎn)有關(guān)分解酶的機(jī)理提供理論依據(jù),從而為其之后的基因改造、產(chǎn)酶能力的提高等研究奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q936;O636.1

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