本文關(guān)鍵詞：茶樹(shù)咖啡堿生物合成關(guān)鍵酶基因的原核表達(dá)及功能驗(yàn)證

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【摘要】：咖啡堿是一種黃嘌呤生物堿化合物,作為常見(jiàn)的嘌呤堿,被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于多種植物種中。人類最常食用的含咖啡堿的植物包括咖啡、茶、可可�？Х葔A不僅是茶葉重要的滋味物質(zhì),而且是茶葉生物堿的主要組分。盡管咖啡堿對(duì)一些特殊人群造成一定負(fù)面影響,如孕婦出現(xiàn)自然流產(chǎn)、早產(chǎn)、低體重兒,但是適量的咖啡堿對(duì)人體有很多積極作用,如提神醒腦、利尿護(hù)肝、促進(jìn)消化等。全球生產(chǎn)的咖啡堿除一部分應(yīng)用于工業(yè)外,大部分被用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。化學(xué)合成的咖啡堿不僅有毒副作用,而且合成過(guò)程中一些物質(zhì)污染環(huán)境,天然提取仍存在設(shè)備昂貴、有毒物質(zhì)殘留等問(wèn)題。生物合成咖啡堿具有無(wú)污染、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)基本掌握茶樹(shù)中咖啡堿生物合成主要途徑和供體途徑,也為生物合成咖啡堿奠定了基礎(chǔ)。具體合成途徑是:腺嘌呤核苷酸(AMP)→次黃嘌呤核苷酸(IMP)→黃嘌呤核苷酸(XMP)→黃嘌呤核苷(XR)→7-甲基黃嘌呤核苷(7-MXR)→7-甲基黃嘌呤(7-MX)→可可堿(Tb)→咖啡堿(Cf)。通過(guò)分析比對(duì)蛋白質(zhì)空間模型,將咖啡堿合成酶(TCS1)進(jìn)行定點(diǎn)突變,突變體TMX突變位置與TCS1相比,分別為:TM1(673CGT→CAT);TM2(949GTT→ATG);TM3(811TTT→TGG);TM4(814GCA→CCA)。咖啡堿合成酶突變體TMX的單獨(dú)表達(dá)中,體外活性檢測(cè)結(jié)果顯示:TM1只能催化7-甲基黃嘌呤生成可可堿,TM2/3/4均能催化7-甲基黃嘌呤生成可可堿和咖啡堿,但是咖啡堿含量較低(該部分工作由茶葉重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成)。本研究在TCS1突變體單獨(dú)表達(dá)基礎(chǔ)上,構(gòu)建了四個(gè)突變體TMX和咖啡黃嘌呤核苷甲基轉(zhuǎn)移酶(CaXMT)的共表達(dá)載體,嘗試通過(guò)大腸桿菌進(jìn)行體外合成咖啡堿,并試圖尋找合成咖啡堿的廉價(jià)底物。論文主要取得以下結(jié)果:(1)將CaXMT和TMX串聯(lián)到同一表達(dá)載體pMAL-c5X上,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行共表達(dá),制備粗酶液并添加底物XR和SAM,體外酶反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測(cè)。結(jié)果顯示,pMAL-CaXMT-TM2/3/4的酶反應(yīng)產(chǎn)物有可可堿生成,但是均未檢測(cè)到咖啡堿生成。pMAL-CaXMT-TM1的酶反應(yīng)產(chǎn)物只有7-MX。(2)表達(dá)載體pRSF-Duet1具有雙啟動(dòng)子,將CaXMT和TMX先后連接到兩個(gè)啟動(dòng)子下,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行共表達(dá)。體外酶反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果顯示,pRSF-CaXMT-TM1的酶反應(yīng)產(chǎn)物為可可堿,pRSF-CaXMT-TM2/3/4的酶反應(yīng)產(chǎn)物均有咖啡堿生成,且pRSF-CaXMT-TM4的咖啡堿生成量最大,為1.89μg/mL。(3)在茶樹(shù)嫩葉中克隆次黃嘌呤核苷酸脫氫酶(TIDH),驗(yàn)證了該酶具有催化次黃嘌呤核苷酸反應(yīng)生成黃嘌呤核苷酸的活性。本研究均是在大腸桿菌中進(jìn)行的,其中CaXMT和TMX在pRSF-Duet1中成功進(jìn)行共表達(dá),可以實(shí)現(xiàn)體外合成咖啡堿。TIDH可通過(guò)輔酶I(NAD+)催化次黃嘌呤核苷酸生成黃嘌呤核苷酸,即黃嘌呤核苷的前體物質(zhì)。本研究不僅為構(gòu)建生物合成咖啡堿的共表達(dá)載體奠定了基礎(chǔ),而且為探索咖啡堿生物合成中廉價(jià)底物提供了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：O629.3

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7 賀賢國(guó);;~(13)C核磁共振譜與生物合成研究[J];化學(xué)通報(bào);1985年11期

8 三川潮;陳壽松;;穩(wěn)定同位素在生物合成研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀[J];原子能農(nóng)業(yè)譯叢;1985年03期

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10 何尊四;;土霉素生物合成調(diào)節(jié)過(guò)程的特性研究[J];國(guó)外藥學(xué)(抗生素分冊(cè));1986年02期

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