本文關(guān)鍵詞：基于超電荷綠色熒光蛋白的新分析方法研究

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【摘要】：超電荷綠色熒光蛋白(supercharged green fluorescent protein, scGFP)是一類表面有很高靜電荷的綠色熒光蛋白,它們具有比普通的綠色熒光蛋白更優(yōu)的性質(zhì),如熒光穩(wěn)定性好、不易聚集、抗鹽能力強(qiáng)、耐受pH能力強(qiáng)等。帶有超多正電荷的綠色熒光蛋白可以穿透細(xì)胞膜,運載DNA、siRNA等生物大分子進(jìn)入細(xì)胞。由于以上優(yōu)點,scGFP在生物化學(xué)領(lǐng)域引到了越來越廣泛的關(guān)注。利用scGFP帶電荷的性質(zhì)及其發(fā)熒光的性質(zhì),可以基于scGFP構(gòu)建傳感分析平臺用于生化分析。本文基于scGFP開發(fā)了一種無標(biāo)記檢測PARP-1活性的新方法。另外,還設(shè)計、構(gòu)建了一種對MMP-2敏感的熒光探針。具體工作如下：1、實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)+36GFP與GO通過靜電作用和π-π堆積作用而結(jié)合,+36GFP的熒光幾乎全部被GO淬滅,而當(dāng)加入適當(dāng)長度的DNA時,DNA會與+36GFP通過靜電作用結(jié)合,形成+36GFP/DNA復(fù)合物,保護(hù)+36GFP的熒光不被GO淬滅。利用聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1 (poly(ADP-ribose) polymerase-1, PARP-1)在損傷DNA的激活下催化發(fā)生聚腺苷二磷酸核糖化產(chǎn)生的聚腺苷二磷酸核糖(PAR)帶大量負(fù)電荷的性質(zhì),構(gòu)建了一種基于+36GFP/GO相互作用無標(biāo)記檢測PARP-1活性的新方法。帶負(fù)電的PAR與+36GFP通過靜電作用結(jié)合,形成+36GFP/PAR復(fù)合物可以有效地抑制GO對+36GFP熒光的淬滅,體系熒光信號的強(qiáng)度直接反映PARP-1的活性,簡單,快速,直接,靈敏度高,檢測限可達(dá)0.002 U/μL,在0.002-0.07 U/μL范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系,為PARP-1酶活性檢測提供了一個新思路,該方法還可用于PARP-1抑制劑的篩選。2、實驗室前期根據(jù)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enchanced green fluorescence protein, EGFP)的結(jié)構(gòu)特性,通過His-tag和Ni2+的配位作用在整體柱上螯合EGFP形成微酶反應(yīng)系統(tǒng),利用凝血酶對凝血酶底物進(jìn)行在線消化釋放EGFP,結(jié)合毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測技術(shù)(capillary electrophoresis-laser-induced fluorescence detection, CE-LIFD),實現(xiàn)對凝血酶的在線檢測�；|(zhì)金屬蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2, MMP-2)是降解IV型膠原最重要的蛋白酶之一,它能促進(jìn)腫瘤的侵襲和遷移,與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。這里,以-30GFP作為熒光報告分子,構(gòu)建對MMP-2敏感的熒光探針MMP-2S-30GFP,探針包括三個部分：N端His-tag,中間MMP-2特異性識別序列(MMP-2 Susbstrate, MMP-2S),C端熒光報告分子-30GFP。通過全基因人工合成法獲得攜帶有MMP-2S-30GFP基因的質(zhì)粒pUCK-mmp-2s-30gfp,用“兩步法”和“一鍋法”得到適用于表達(dá)的重組質(zhì)粒pET28a-mmp-2s-30gfp,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌IPTG誘導(dǎo)表達(dá),通過鎳柱純化得到高純度的對MMP-2敏感的熒光探針MMP-2S-30GFP,通過變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)、紫外吸收光譜和熒光光譜對其進(jìn)行表征。為之后與毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合,發(fā)展一種高靈敏新型在線檢測MMP-2的新方法打下堅實的基礎(chǔ),為利用不同超電荷熒光蛋白荷質(zhì)比不同實現(xiàn)多種酶的同時在線檢測提供了思路。
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O657.3

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1 王姍姍;;小分子熒光探針在硫醇檢測中的最新研究進(jìn)展[J];科技信息;2010年23期

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本文編號：1156727