本文關鍵詞：功能性聚合物的定點修飾對增強蛋白質穩(wěn)定性的研究

  更多相關文章： 聚合物 蛋白質偶聯(lián)物 定位修飾 生物學活性及穩(wěn)定性

【摘要】：蛋白質作為生物體內不可或缺的組成成分,不僅是專一高效的催化劑,而且可作為用于疾病的診斷和治療的活性藥物。雖然蛋白質在生物學反應,酶工程,分子生物學以及臨床治療中應用廣泛,但由于蛋白質自身結構的復雜性和脆弱性往往在復雜的應用環(huán)境中表現(xiàn)出較差的穩(wěn)定性和生物學活性,使得蛋白質的應用受到了一定的限制。如何有效提高蛋白質在復雜環(huán)境中的活性及穩(wěn)定性迫在眉睫,同時也是拓寬蛋白質應用范圍的關鍵問題所在。其中利用聚合物對蛋白質進行修飾從而提高蛋白質的性能得到越來越多科研工作者的關注。為此,本論文利用可逆加成斷裂鏈轉移(RAFT)聚合以及合成化學制備出一系列不同類型、不同鏈長且末端帶有吡啶二硫酯基團的功能性聚合物,與蛋白質無機焦磷酸酶(PPase)上特定位點突變的半胱氨酸巰基進行反應制備得到聚合物-蛋白質偶聯(lián)物,系統(tǒng)地研究了聚合物-蛋白質偶聯(lián)物在不同環(huán)境因子改變的條件下的生物活性及穩(wěn)定性,并進一步探討了聚合物-蛋白質偶聯(lián)物在生物催化反應和生物醫(yī)學中的應用。具體研究內容如下:首先,利用基因定點突變技術在PPase活性中心附近的148位賴氨酸殘基突變成半胱氨酸殘基,構建了無機焦磷酸酶單點突變體K148C,并與RAFT聚合制備獲得的不同鏈長的聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)結合形成偶聯(lián)物PNIPAM-PPase。溫敏性聚合物PNIPAM的修飾使得PPase的溫度耐受閾值顯著提高,其最適反應溫度由未修飾酶的45oC提升至60oC;同時,蛋白質的高溫耐受能力和熱穩(wěn)定性也明顯改善,當修飾的PNIPAM分子量達到66 000時,偶聯(lián)物在60oC下孵育3小時,其活性保留有77%左右,是未修飾酶的6.8倍。研究結果顯示了偶聯(lián)物PNIPAM-PPase在高溫條件下優(yōu)異的溫度耐受性和熱穩(wěn)定性,為蛋白質在體外不利的高溫條件下保持較高的生物活性和穩(wěn)定性提供了新的研究策略。然后,我們進一步探討了偶聯(lián)物PNIPAM-PPase在生物酶催化反應中的應用。聚合酶鏈式反應(PCR)是分子生物學和基因工程的關鍵技術,在生物工程與臨床診斷中至關重要。但因該反應副產物焦磷酸根(PPi)的積累會阻礙反應向正方向的順暢進行,使得反應效率降低。而傳統(tǒng)分解PPi的方法無法適應PCR長時間的高溫反應條件。因此,我們將制備的PNIPAM-PPase偶聯(lián)物引入到PCR反應中,通過分解PCR反應過程中生成的PPi,在不影響反應特異性的情況下,使得PCR反應效率提高了1.5倍,達到顯著促進PCR的效果。不僅如此,偶聯(lián)物在PCR的高溫且長時間循環(huán)的反應環(huán)境中仍能保持很高的分解PPi的活性,當循環(huán)次數(shù)達到100次時,偶聯(lián)物能保留大約78%的活性。該策略為實現(xiàn)蛋白質在不利的高溫環(huán)境下保持有效的生物學活性和穩(wěn)定性提供了可行的途徑和有意義的探索。最后,考慮到PNIPAM為外源性聚合物存在生物相容性的問題,在體內應用方面可能存在一定的限制,因此我們進一步地探究聚糖的修飾對蛋白質的生物學活性的影響。通過相同的策略制備糖聚物-蛋白質偶聯(lián)物從而模擬糖蛋白。我們利用甲基丙烯酰氯與氨基葡萄糖的酰胺化反應制備出一種乙酰氨基葡萄糖(Glc NAc)的單體類似物甲基丙烯酰胺葡萄糖(MAG),并通過RAFT聚合制備了一系列不同分子量的糖聚物(PMAG)。利用定點突變技術獲得突變體N124C,制備出糖蛋白類似物(PMAG-PPase)。糖聚物的引入極大地提高了蛋白質的活性,且表現(xiàn)為較小分子量的糖聚物顯示出較高的活性,當修飾的分子量為8 000的PMAG時,蛋白質的活性提高至14.12±0.66 kat/kg。不僅如此,與天然糖蛋白效果類似,偶聯(lián)物在較強酸堿溶液,高鹽溶液以及蛋白酶等復雜條件下同樣表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性;與此同時,得益于糖聚物獨特的C-C主鏈結構,PMAG-PPase能夠有效避免天然糖蛋白所無法避免的糖苷酶的降解,顯示了其獨特的優(yōu)勢。而且,通過蛋白質自身能夠有效分解PPi的特點,PMAG-PPase能夠有效水解焦磷酸鈣,從而在治療焦磷酸鈣沉積病(CPDD):類痛風這一疑難雜癥中具有巨大的潛力。這種糖蛋白類似物在生物檢測和臨床治療中顯示出極高的價值。綜上所述,通過定點修飾的方式構建了一系列不同類型不同鏈長的聚合物-蛋白質偶聯(lián)物,系統(tǒng)地研究了蛋白質在不同環(huán)境下的活性和穩(wěn)定性的影響情況,總結出一些經驗和規(guī)律,并在生物學反應及疾病診療得到了初步的應用。通過功能性聚合物的定位修飾從而增強蛋白質的穩(wěn)定性能夠在生物工程及臨床診斷中擁有良好的應用前景。
【關鍵詞】：聚合物 蛋白質偶聯(lián)物 定位修飾 生物學活性及穩(wěn)定性
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：O631;TQ931
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 第1章 緒論13-26
• 1.1 聚合物-蛋白質偶聯(lián)技術的研究進展13-14
• 1.2 聚合物-蛋白質偶聯(lián)物的制備策略14-21
• 1.2.1 “Grafting to”策略15-18
• 1.2.2 “Grafting from”策略18-21
• 1.3 聚合物對蛋白質的活性調控21-23
• 1.3.1 PEG類偶聯(lián)物21
• 1.3.2 刺激響應性偶聯(lián)物21-22
• 1.3.3 仿生型偶聯(lián)物22-23
• 1.4 聚合物-蛋白質偶聯(lián)物的應用23
• 1.5 課題的提出23-26
• 1.5.1 研究目的及意義23-25
• 1.5.2 研究內容及實驗方案25-26
• 第2章 溫度響應性聚合物對蛋白質熱穩(wěn)定性的研究26-41
• 2.1 引言26-27
• 2.2 實驗部分27-34
• 2.2.1 材料與試劑27-28
• 2.2.2 實驗儀器28-29
• 2.2.3 構建K148C PPase突變體29-30
• 2.2.4 NIPAM的RAFT聚合30
• 2.2.5 PNIPAM的吡啶二硫酯功能化30-31
• 2.2.6 聚合物的表征31-32
• 2.2.7 PNIPAM-PPase偶聯(lián)物的制備32
• 2.2.8 低臨界共溶溫度（LCST）的測定32
• 2.2.9 自由巰基密度32-33
• 2.2.10 PPase及偶聯(lián)物的活性測定33-34
• 2.2.11 蛋白質及偶聯(lián)物的活性溫度曲線以及熱穩(wěn)定性的測定34
• 2.3 結果與討論34-40
• 2.3.1 PNIPAM的合成以及偶聯(lián)物的制備34-38
• 2.3.2 偶聯(lián)物的活性溫度曲線38-39
• 2.3.3 偶聯(lián)物的熱穩(wěn)定性研究39-40
• 2.4 本章小結40-41
• 第3章 偶聯(lián)物增強的聚合酶鏈反應41-48
• 3.1 前言41-42
• 3.2 實驗部分42-45
• 3.2.1 材料與試劑42
• 3.2.2 實驗儀器42-43
• 3.2.3 PNIPAM-PPase增強PCR43-44
• 3.2.4 PCR擴增44
• 3.2.5 PNIPAM-PPase在不同擴增條件下的穩(wěn)定性研究44-45
• 3.3 結果與討論45-46
• 3.4 本章小結46-48
• 第4章 糖聚物對蛋白質在復雜環(huán)境下的穩(wěn)定性研究48-65
• 4.1 前言48-49
• 4.2 實驗部分49-55
• 4.2.1 材料與試劑49-50
• 4.2.2 實驗儀器50-51
• 4.2.3 N124C PPase突變體的構建51
• 4.2.4 甲基丙烯酰胺葡萄糖（MAG）的合成51
• 4.2.5 MAG的RAFT聚合51-52
• 4.2.6 PMAG的吡啶二硫酯功能化52
• 4.2.7 聚合物的表征52-53
• 4.2.8 PMAG-PPase偶聯(lián)物的制備53
• 4.2.9 自由巰基密度53
• 4.2.10 PPase及偶聯(lián)物的活性測定53
• 4.2.11 蛋白質及偶聯(lián)物穩(wěn)定性的測定53-54
• 4.2.12 PMAG-PPase水解焦磷酸鈣（CPP）實驗54-55
• 4.3 結果與討論55-64
• 4.3.1 糖聚物的合成以及偶聯(lián)物的制備55-58
• 4.3.2 糖聚物的修飾對PPase的活性影響58-59
• 4.3.3 偶聯(lián)物在不同p H值下的活性變化59-60
• 4.3.4 偶聯(lián)物在高鹽溶液中穩(wěn)定性情況60-61
• 4.3.5 偶聯(lián)物抗蛋白酶水解效果的研究61-62
• 4.3.6 偶聯(lián)物耐糖苷酶糖解效果的研究62-63
• 4.3.7 偶聯(lián)物催化焦磷酸鈣（CPP）水解效果的研究63-64
• 4.4 本章小結64-65
• 第5章 論文總結與展望65-68
• 5.1 論文總結65-66
• 5.2 展望66-68
• 參考文獻68-77
• 碩士論文工作期間科研成果77-78
• 致謝78-80

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