本文關(guān)鍵詞：隱性孔雀石綠多克隆抗體的制備及電化學(xué)阻抗免疫傳感器的組裝

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【摘要】：隱性孔雀石綠是三苯甲烷類化學(xué)物孔雀石綠在生物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物和存在形式,殘留時(shí)間長(zhǎng),由于其潛在的高毒、高殘留、“三致”等毒副作用,很多國(guó)家,包括我國(guó)已經(jīng)嚴(yán)格限制其使用,但是違規(guī)添加事件屢有發(fā)生,給人類健康帶來嚴(yán)重威脅。因此,極有必要建立隱性孔雀石綠及孔雀石綠的快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法,得到科學(xué)即時(shí)的結(jié)果,這樣才能實(shí)現(xiàn)有效監(jiān)督,保障和促進(jìn)我國(guó)水產(chǎn)品行業(yè)的發(fā)展。本文研究的具體內(nèi)容如下:根據(jù)化學(xué)合成原則和半抗原設(shè)計(jì)要求,采用以原料為基礎(chǔ),從源頭進(jìn)行合成的方法,合成了四種含不同基團(tuán)和長(zhǎng)度連接臂的半抗原,并且提出了一種新的隱性孔雀石綠半抗原的合成路徑,以純碳鏈作為連接臂,并可以通過更換反應(yīng)物實(shí)現(xiàn)連接臂的延長(zhǎng)。對(duì)設(shè)計(jì)合成的目標(biāo)產(chǎn)物分別進(jìn)行薄層色譜法、質(zhì)譜掃描和核磁氫譜鑒定,證實(shí)已成功制備隱性孔雀石綠半抗原,且純度均在95%以上。將設(shè)計(jì)合成的半抗原分別通過碳二亞胺法與BSA和OVA偶聯(lián),并且經(jīng)過紫外光譜和MALDI-TOF-MS對(duì)完全抗原進(jìn)行鑒定和偶聯(lián)比的計(jì)算,結(jié)果表明完全抗原制備成功,且免疫原的偶聯(lián)比介于10:1~20:1之間。選用適齡兔進(jìn)行多克隆抗體的免疫制備,用ELISA方法檢測(cè)得到的抗血清的效價(jià)和靈敏度,確定反應(yīng)終點(diǎn)。選用效果最好的抗血清,進(jìn)行ELISA工作條件的優(yōu)化,建立隱性孔雀石綠酶聯(lián)免疫吸附分析方法。結(jié)果表明,建立的隱性孔雀石綠ELISA檢測(cè)方法的靈敏度為2.21 ng/mL,線性范圍為0.15~31.7 ng/mL,最低檢測(cè)限為0.06 ng/mL,并用于魚肉樣品的實(shí)際檢測(cè)中,回收率為79.8~92.4%。選用優(yōu)化得到的抗體進(jìn)行電化學(xué)阻抗免疫傳感器的組裝,并用電化學(xué)阻抗譜進(jìn)行定性和定量分析。通過對(duì)苯二胺重氮化修飾玻碳電極,將蛋白還原的納米金簇共價(jià)連接到電極表面,并用EDC/NHS作為活化劑,將隱性孔雀石綠多克隆抗體以共價(jià)連接的方式固定到了修飾過的玻碳電極表面,BSA封閉,以減少非特異吸附對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。根據(jù)抗體抗原特異性反應(yīng)前后電極表面電阻值的變化對(duì)隱性孔雀石綠進(jìn)行了檢測(cè),檢測(cè)限為0.03 ng/mL,檢測(cè)范圍是0.1~10 ng/mL,并且具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性,可以實(shí)現(xiàn)水樣中隱性孔雀石綠和孔雀石綠的檢測(cè)。
【關(guān)鍵詞】：隱性孔雀石綠 孔雀石綠 多克隆抗體 酶聯(lián)免疫吸附法 電化學(xué)阻抗免疫傳感器
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：O657.1;TP212.2
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-15
• 第一章 引言15-24
• 1.1 隱性孔雀石綠概況15-16
• 1.2 隱性孔雀石綠和孔雀石綠檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展16-18
• 1.2.1 樣品的前處理16
• 1.2.2 常用的檢測(cè)方法16-18
• 1.3 電化學(xué)阻抗譜（EIS）技術(shù)18-22
• 1.3.1 電化學(xué)阻抗譜的基本原理18-20
• 1.3.2 電化學(xué)阻抗譜分析法在生物傳感器中的應(yīng)用20-22
• 1.4 本實(shí)驗(yàn)的研究?jī)?nèi)容和目的22-24
• 第二章 隱性孔雀石綠半抗原的合成與鑒定24-32
• 2.1 前言24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料24-25
• 2.2.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑24
• 2.2.2 主要儀器設(shè)備24-25
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法25-29
• 2.3.1 隱性孔雀石綠半抗原I的合成25-26
• 2.3.2 隱性孔雀石綠半抗原II的合成26
• 2.3.3 隱性孔雀石綠半抗原III的合成26-27
• 2.3.4 隱性孔雀石綠半抗原IV的合成27-29
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析29-31
• 2.4.1 半抗原I的合成結(jié)果鑒定29-30
• 2.4.2 半抗原II的合成結(jié)果鑒定30
• 2.4.3 半抗原III的合成結(jié)果鑒定30-31
• 2.4.4 半抗原IV的合成結(jié)果鑒定31
• 2.5 本章小結(jié)31-32
• 第三章 隱性孔雀石綠多克隆抗體的制備及酶聯(lián)免疫吸附法的建立32-44
• 3.1 前言32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料32-33
• 3.2.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑32
• 3.2.2 主要溶液配制32-33
• 3.2.3 主要儀器設(shè)備33
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法33-36
• 3.3.1 隱性孔雀石綠免疫原與包被原的制備33
• 3.3.2 人工抗原的檢測(cè)及結(jié)合比的測(cè)定33-34
• 3.3.3 隱性孔雀石綠多克隆抗體的制備34-35
• 3.3.4 抗體的純化與靈敏度測(cè)定35-36
• 3.3.5 抗血清的特異性鑒定36
• 3.3.6 樣品前處理36
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析36-43
• 3.4.1 人工抗原的鑒定及結(jié)合比的測(cè)定36-38
• 3.4.2 抗血清效價(jià)的測(cè)定38
• 3.4.3 包被抗原對(duì)間接ELISA的影響38-39
• 3.4.4 抗體純化結(jié)果鑒定及標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的建立39-40
• 3.4.5 隱性孔雀石綠多克隆抗體交叉性分析40-41
• 3.4.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)41-43
• 3.5 本章小結(jié)43-44
• 第四章 隱性孔雀石綠電化學(xué)阻抗免疫傳感器的組裝44-53
• 4.1 前言44
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料44-45
• 4.2.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑44
• 4.2.2 主要試驗(yàn)儀器44-45
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法45-46
• 4.3.1 BSA還原的納米金簇（BSA-AuNCs）的制備45
• 4.3.2 免疫傳感器的組裝45-46
• 4.3.3 電化學(xué)檢測(cè)46
• 4.3.4 樣品收集和前處理46
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析46-52
• 4.4.1 重氮化修飾電極和BSA-AuNCs的表征46-47
• 4.4.2 免疫傳感器組裝過程的表征47-49
• 4.4.3 隱性孔雀石綠抗體的濃度和孵育時(shí)間優(yōu)化49
• 4.4.4 免疫反應(yīng)中孵育時(shí)間和pH值優(yōu)化49-50
• 4.4.5 免疫傳感器對(duì)抗原的響應(yīng)50-51
• 4.4.6 免疫傳感器重現(xiàn)性和穩(wěn)定性的測(cè)定51
• 4.4.7 分析應(yīng)用51-52
• 4.5 本章小結(jié)52-53
• 第五章 結(jié)論53-55
• 5.1 工作結(jié)論53
• 5.2 工作展望53-55
• 參考文獻(xiàn)55-62
• 附錄62-68
• 致謝68-69
• 作者簡(jiǎn)歷69-70

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 JIANG Yousheng;CHEN Li;HU Kun;YU Wenjuan;YANG Xianle;LU Liqun;;Development of a Fast ELISA for the Specific Detection of both Leucomalachite Green and Malachite Green[J];Journal of Ocean University of China;2015年02期

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本文編號(hào)：1092555