本文關(guān)鍵詞：環(huán)境友好纖維素酶在離子液體—溶劑體系中的應(yīng)用基礎(chǔ)研究

  更多相關(guān)文章： 離子液體 纖維素酶 類芽孢桿菌sp.LLZ1 原位酶解 抑制

【摘要】：生物質(zhì)資源的開發(fā)利用是實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的重要手段。纖維素是地球上最為豐富的生物質(zhì)資源之一,離子液體(IL)預(yù)處理及原位酶解作為實現(xiàn)纖維素資源有效利用的最新手段,受到廣泛關(guān)注。然而,當(dāng)前研究大多使用商品化的真菌纖維素酶,缺少對細(xì)菌纖維素酶的開發(fā)與利用;同時,IL存在價格昂貴、抑制酶活等缺點。為了克服這些問題,進(jìn)而提高纖維素原位酶解的可行性,本文主要開展了以下研究:首先,從蘇州上方山國家森林公園土壤樣品中分離得到110株細(xì)菌,通過羧甲基纖維素鈉平板初篩和產(chǎn)酶能力比較,得到一株產(chǎn)纖維素酶能力強的菌株,編號為LLZ1。該菌所產(chǎn)纖維素酶以1.00 g/L微晶纖維素為底物,水解24 h后葡萄糖產(chǎn)量達(dá)0.13 g/L。通過形態(tài)觀察和16s rRNA基因序列比對,鑒定該菌屬于類芽孢桿菌屬(Paenibacillu),與P.cellulosilyticus同源性最高(99%)。其次,在獲得纖維素酶產(chǎn)生菌LLZ1的基礎(chǔ)上,將二甲亞砜(DMSO)/IL這一更優(yōu)良的二元預(yù)處理溶劑引入纖維素原位酶解體系�？疾�5種DMSO/IL組合的應(yīng)用效果后,構(gòu)建并優(yōu)化了一套新型水-DMSO/[EMIM]DEP-纖維素酶原位酶解體系。最優(yōu)條件下微晶纖維素和甘蔗纖維素的轉(zhuǎn)化率分別提高了39.3%和37.6%。DMSO/IL二元溶劑的應(yīng)用,使IL用量減少70.0%,降低了工藝成本。該體系中LLZ1纖維素酶的最優(yōu)反應(yīng)條件為40°C、pH 6.0,與現(xiàn)有其他原位酶解體系相比,反應(yīng)溫度低,pH近中性。因此LLZ1纖維素酶具備節(jié)約能耗、環(huán)境友好的特點。最后,針對纖維素酶活性普遍受IL抑制的問題,以LLZ1纖維素酶為研究對象,探究天然多樣性的纖維素酶在IL體系中的失活機制及改善方法。首先分別以不同纖維素為底物,測定各濃度[EMIM]DEP對酶活的抑制效果,結(jié)果表明LLZ1纖維素酶受[EMIM]DEP的抑制具有底物依賴性。隨后動力學(xué)參數(shù)分析顯示Km顯著升高,表明[EMIM]DEP降低了酶與底物的親和度。而Vmax變化較小,進(jìn)一步深入研究證明LLZ1纖維素酶在更高底物濃度時受到的抑制更小。接著SDS-PAGE酶譜分析顯示在低于30.0%的[EMIM]DEP中內(nèi)切β-葡聚糖酶表現(xiàn)為可逆失活;在高于40.0%[EMIM]DEP中開始出現(xiàn)不可逆失活。LLZ1產(chǎn)生的不同內(nèi)切β-葡聚糖酶對[EMIM]DEP耐受能力有所差異。最后,添加金屬離子和表面活性劑有助于改善[EMIM]DEP溶液中的酶活力,0.7 mM的Ca~(2+)和0.5‰的Tween80分別使酶活力提高31.2%、48.4%。本文的研究為生物質(zhì)轉(zhuǎn)化利用提供了技術(shù)支撐;為探索纖維素酶在離子液體體系中的活性變化提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：離子液體 纖維素酶 類芽孢桿菌sp.LLZ1 原位酶解 抑制
【學(xué)位授予單位】：蘇州科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O629.8;O645.1
【目錄】：

• 中文摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-24
• 1.1 引言12
• 1.2 纖維素12-13
• 1.3 纖維素酶13-14
• 1.4 纖維素的預(yù)處理14-20
• 1.4.1 離子液體14-15
• 1.4.2 離子液體預(yù)處理纖維素15-20
• 1.5 纖維素的酶解20-22
• 1.5.1 酶解策略20-21
• 1.5.2 纖維素酶在離子液體體系中酶活性變化21-22
• 1.6 文章的內(nèi)容、目的及意義22-24
• 1.6.1 研究主要內(nèi)容22-23
• 1.6.2 研究目的及意義23-24
• 第二章 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選及分子鑒定24-32
• 2.1 引言24
• 2.2 材料和方法24-27
• 2.2.1 試劑和材料24-25
• 2.2.2 主要儀器25
• 2.2.3 培養(yǎng)基25-26
• 2.2.4 菌種的篩選26
• 2.2.5 菌的電子顯微鏡觀察26
• 2.2.6 16s rRNA基因PCR擴增和序列分析26-27
• 2.3 結(jié)果與討論27-31
• 2.3.1 菌種篩選27-28
• 2.3.2 菌的特征28-29
• 2.3.3 16s rRNA基因PCR擴增和序列分析29-31
• 2.4 本章小結(jié)31-32
• 第三章 DMSO/IL預(yù)處理纖維素及其原位酶解體系的構(gòu)建32-42
• 3.1 引言32-33
• 3.2 材料和方法33-35
• 3.2.1 試劑和材料33
• 3.2.2 主要儀器33-34
• 3.2.3 培養(yǎng)基34
• 3.2.4 甘蔗纖維素提取34
• 3.2.5 纖維素的預(yù)處理以及原位酶解34
• 3.2.6 原位酶解參數(shù)的優(yōu)化34-35
• 3.2.7 測試分析方法35
• 3.3 結(jié)果與討論35-41
• 3.3.1 離子液體的選擇35-36
• 3.3.2 溫度和pH對原位酶解的影響36-37
• 3.3.3 DMSO/[EMIM]DEP比例對原位酶解的影響37-38
• 3.3.4 DMSO/[EMIM]DEP濃度對原位酶解的影響38
• 3.3.5 原位酶解的時間進(jìn)程38-41
• 3.4 本章小節(jié)41-42
• 第四章 類芽孢桿菌sp. LLZ1纖維素酶在IL溶液中的穩(wěn)定性42-52
• 4.1 引言42-43
• 4.2 材料和方法43-45
• 4.2.1 試劑和材料43
• 4.2.2 主要儀器43-44
• 4.2.3 培養(yǎng)基44
• 4.2.4 纖維素酶活性分析44
• 4.2.5 酶促反應(yīng)動力學(xué)分析44
• 4.2.6 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳44-45
• 4.3 結(jié)果與討論45-51
• 4.3.1 [EMIM]DEP對LLZ1纖維素酶活性影響45-46
• 4.3.2 [EMIM]DEP對酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的影響46-47
• 4.3.3 類芽孢桿菌sp.LLZ1纖維素酶的天然多樣性47-49
• 4.3.4 [EMIM]DEP對LLZ1天然多樣性纖維素酶抑制機理49
• 4.3.5 [EMIM]DEP體系中LLZ1纖維素酶活性的改善49-51
• 4.4 本章小節(jié)51-52
• 第五章 結(jié)論與展望52-54
• 5.1 主要結(jié)論52-53
• 5.2 展望53
• 5.3 本文的創(chuàng)新點53-54
• 參考文獻(xiàn)54-62
• 致謝62-63
• 附錄63-65
• 作者簡介65

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