本文關(guān)鍵詞：氧化葡萄糖酸桿菌全細(xì)胞催化木糖酸關(guān)鍵性抑制物的分子響應(yīng)機(jī)制

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【摘要】：本論文針對氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans NL71)全細(xì)胞原位催化木質(zhì)纖維原料稀酸水解液合成木糖酸的抑制問題,測試并篩選出三種典型抑制物甲酸、糠醛和對羥基苯甲醛,研究了它們對木糖酸全細(xì)胞催化抑制的反應(yīng)動力學(xué)�；诟咄繙y序技術(shù)測定G.oxydans NL71的全基因組,以此為對照建立三種抑制物物條件下的全細(xì)胞催化木糖合成木糖酸的特征轉(zhuǎn)錄譜,通過RQ-PCR分析解析抑制物響應(yīng)的關(guān)鍵基因并探索其分子調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果表明,甲酸、糠醛和對羥基苯甲醛是氧化葡萄糖酸桿菌全細(xì)胞原位催化木質(zhì)纖維原料稀酸水解液合成木糖酸的主要抑制物。5 g/L甲酸、8 g/L糠醛、3 g/L對羥基苯甲醛單獨(dú)存在時即對細(xì)胞催化性能產(chǎn)生明顯的抑制毒性,導(dǎo)致木糖利用速率和木糖酸產(chǎn)率顯著下降。基于木質(zhì)纖維原料木糖氧化葡萄糖酸桿菌全細(xì)胞催化制取木糖酸的生產(chǎn)水平分析,甲酸抑制作用最為明顯,其次為糠醛和對羥基苯甲醛�；贖iseq 2500和Miseq測序平臺完成G.oxydans NL71基因組測序工作并提交至NCBI(編號LCTG00000000)。G.oxydans NL71基因組大小為3.25 Mb,GC含量55.71%,含有編碼基因3226個,非編碼基因(59個tRNA,5組rRNA),基因島11個,前噬菌體3個。G.oxydans NL71基因組基因功能注釋分析,GO、KEGG、COG、NR、Swiss-Prot、TrEMBL注釋得到的結(jié)果分別為1124、1758、1600、3012、1161和2964。采用Hiseq 2000高通量測序平臺測定在甲酸、糠醛和對羥基苯甲醛條件下氧化葡萄糖桿菌全細(xì)胞催化木糖合成木糖酸的的轉(zhuǎn)錄組。通過與空白對照比較研究,在分子轉(zhuǎn)錄水平上分別獲得甲酸、糠醛、對羥基苯甲酸響應(yīng)的目標(biāo)基因572、714和408個。結(jié)合實(shí)時轉(zhuǎn)錄PCR驗證進(jìn)一步篩選得到19個主要的抑制物響應(yīng)基因,主要包括:糖酵解途徑的甘油醛3-磷酸脫氫酶(NL71GM001713),三羧酸循環(huán)的2-酮戊二酸脫氫酶(NL71GM001355),磷酸戊糖途徑的核糖5-磷酸異構(gòu)酶(NL71GM001290),細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和分泌系統(tǒng)的蛋白(NL71GM001291、NL71GM001292、NL71GM000616、NL71GM002123),細(xì)菌化學(xué)趨向性蛋白(NL71GM000741、NL71GM000736),電子傳遞的硫氧化還原蛋白(NL71GM000876)、NAD(P)轉(zhuǎn)氫酶組成亞基(NL71GM002001)、乙醇脫氫酶(NL71GM001165)、鐵氧化還原酶(NL71GM000337)、單硫基谷氧還蛋白(NL71GM002512),細(xì)胞脫毒作用的過氧化物氧化還原酶(NL71GM001610)、烷基過氧化氫還原酶(NL71GM001611)、谷肽甘肽過氧化物酶(NL71GM000375)、超氧化物岐化酶(NL71GM002096)和細(xì)胞色素c過氧化物酶(NL71GM000364)。在此基礎(chǔ)上,結(jié)合細(xì)胞生理生化和代謝流探討了上述差異基因所對應(yīng)的生物學(xué)功能。
【關(guān)鍵詞】：木糖酸 全細(xì)胞催化 氧化葡萄糖酸桿菌 抑制物 分子機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：南京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;O643.31
【目錄】：

• 致謝3-4
• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 1 前言10-12
• 1.1 研究背景10
• 1.2 立題依據(jù)10-12
• 2 文獻(xiàn)綜述12-21
• 2.1 木糖酸12-14
• 2.1.1 木糖酸12
• 2.1.2 木糖酸的功能與用途12-13
• 2.1.3 木糖酸的合成13-14
• 2.2 氧化葡萄糖酸桿菌14-17
• 2.2.1 微生物學(xué)基礎(chǔ)14
• 2.2.2 基因組研究14-15
• 2.2.3 脫氫酶系統(tǒng)15-17
• 2.3 木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化抑制物17-18
• 2.3.1 抑制物及形成17-18
• 2.3.2 發(fā)酵抑制機(jī)制18
• 2.4 轉(zhuǎn)錄譜與分子機(jī)制研究18-21
• 2.4.1 轉(zhuǎn)錄組與轉(zhuǎn)錄組學(xué)概述及研究意義18-19
• 2.4.2 利用RNA-Seq技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究19
• 2.4.3 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的RQ-PCR驗證19-21
• 3 典型抑制物條件下木糖酸全細(xì)胞催化反應(yīng)動力學(xué)21-29
• 3.1 實(shí)驗材料21-22
• 3.1.1 菌種21
• 3.1.2 試劑21
• 3.1.3 主要儀器21-22
• 3.1.4 培養(yǎng)基22
• 3.2 實(shí)驗方法22-23
• 3.2.1 菌種培養(yǎng)與全細(xì)胞催化22
• 3.2.2 糖-糖酸的測定22-23
• 3.2.3 甲酸、糠醛的定量分析23
• 3.2.4 對羥基苯甲醛的定量分析23
• 3.3 結(jié)果與討論23-28
• 3.3.1 甲酸對木糖酸全細(xì)胞催化合成的抑制23-25
• 3.3.2 糠醛對木糖酸全細(xì)胞合成的抑制25-26
• 3.3.3 對羥基苯甲醛對木糖酸全細(xì)胞催化合成的抑制26-28
• 3.4 小結(jié)28-29
• 4 氧化葡萄糖酸桿菌基因組測序29-40
• 4.1 實(shí)驗材料29-30
• 4.1.1 菌種29
• 4.1.2 試劑29
• 4.1.3 主要儀器29
• 4.1.4 培養(yǎng)基29
• 4.1.5 16S rDNA引物29-30
• 4.2 實(shí)驗方法30-31
• 4.2.1 菌種培養(yǎng)30
• 4.2.2 基因組DNA提取及檢測30
• 4.2.3 16S rDNA PCR30
• 4.2.4 基因組測序30
• 4.2.5 基因組序列的組裝30-31
• 4.2.6 基因組的組分預(yù)測31
• 4.2.7 基因預(yù)測、注釋與功能分析31
• 4.3 結(jié)果與討論31-39
• 4.3.1 基因組DNA樣品質(zhì)量檢測31-32
• 4.3.2 16S rDNA細(xì)菌菌種鑒定32-33
• 4.3.3 基因組測序結(jié)果數(shù)據(jù)概況33-34
• 4.3.4 基因組概況34-36
• 4.3.5 基因組組分分析36-37
• 4.3.6 基因功能分析37-39
• 4.4 小結(jié)39-40
• 5 典型抑制物木糖酸全細(xì)胞催化轉(zhuǎn)錄譜比較研究40-50
• 5.1 實(shí)驗材料40
• 5.1.1 菌種40
• 5.1.2 試劑40
• 5.1.3 主要儀器40
• 5.1.4 培養(yǎng)基40
• 5.2 實(shí)驗方法40-41
• 5.2.1 菌種培養(yǎng)與全細(xì)胞催化40
• 5.2.2 RNA的提取40
• 5.2.3 Total RNA樣品質(zhì)量檢測40-41
• 5.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序41
• 5.3 結(jié)果與討論41-49
• 5.3.1 G. oxydans NL71樣品制備41
• 5.3.2 G. oxydans NL71樣品質(zhì)量分析41-42
• 5.3.3 RNA-Seq文庫制備及測序42
• 5.3.4 測序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計42-43
• 5.3.5 Reads與參考基因組比對情況統(tǒng)計43-44
• 5.3.6 基因表達(dá)水平分析44
• 5.3.7 差異表達(dá)分析44-46
• 5.3.8 基于GO、KEGG的差異基因分析46-48
• 5.3.9 主要差異基因的篩選48-49
• 5.4 小結(jié)49-50
• 6 差異基因?qū)崟r熒光定量PCR驗證50-61
• 6.1 實(shí)驗材料50
• 6.1.1 菌種50
• 6.1.2 試劑50
• 6.1.3 主要儀器50
• 6.1.4 培養(yǎng)基50
• 6.2 實(shí)驗方法50-52
• 6.2.1 RQ-PCR引物設(shè)計50-51
• 6.2.2 菌種培養(yǎng)與全細(xì)胞催化51
• 6.2.3 RNA提取51
• 6.2.4 RNA樣品質(zhì)量檢測51
• 6.2.5 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA51
• 6.2.6 普通PCR反應(yīng)51
• 6.2.7 RQ-PCR反應(yīng)51-52
• 6.3 結(jié)果與討論52-60
• 6.3.1 RQ-PCR基因的引物設(shè)計及驗證52-54
• 6.3.2 相對標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制54-56
• 6.3.3 RQ-PCR驗證結(jié)果56-60
• 6.4 小結(jié)60-61
• 7 結(jié)論與展望61-63
• 7.1 結(jié)論61-62
• 7.2 展望62-63
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文63-64
• 附錄64-65
• 參考文獻(xiàn)65-71

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本文編號：1014036