本文關鍵詞：碳原子數(shù)目及官能團對有機氟化合物與DNA毒性作用影響的研究

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【摘要】：近年來,環(huán)境污染問題逐漸成為困擾世界各國發(fā)展的瓶頸,因此,環(huán)境污染與健康的關系越來越受到人們的關注。持久性有機污染物(POPs)主要來源于人類生產和生活活動,持久性有機污染物會通過直接或間接的方式干擾生物體的內分泌以及生殖、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)等,造成嚴重后果。全氟有機化合物中的PFOS就是一類常見的POPs。 DNA是生物體遺傳信息“譜圖”,與蛋白質的合成和遺傳信息的表達有關,在生物的生命活動中作用顯著。經(jīng)研究報道,持久性有機污染物能夠造成DNA損傷,引發(fā)基因突變、染色體畸變等嚴重問題,甚至導致惡性腫瘤。研究不同碳原子數(shù)目和官能團有機氟化合物對DNA的毒性作用具有非常重要的意義。有機氟化合物,是指分子中全部或部分C-H鍵轉化為C-F鍵的有機化合物。目前,最常見的有機氟化合物主要是全氟化合物(PFAAs)及氟喹諾酮類藥物(FQs)兩大類。我們選取全氟戊酸(PFPA)、全氟辛酸(PFOA)和全氟癸酸(PFDA)這三種碳原子數(shù)目不同的PFAAs為研究對象,以小鼠原代肝細胞和小牛胸腺DNA (ctDNA)為靶物質,通過體外模擬生理條件,分別從細胞水平和分子水平兩個層面研究PFAAs引發(fā)DNA損傷的機理,并探究碳原子數(shù)目對PFAAs毒性作用的影響。同時,我們選取恩諾沙星(ENFX)為FQs代表化合物,以小牛胸腺DNA (ctDNA)為靶分子,結合PFAAs分子毒性機理,探究官能團對有機氟化合物毒性機理的影響。論文由以下三部分組成：第一部分：通過細胞countviability實驗、彗星實驗、8-OHdG含量測定及細胞ROS水平測定等較系統(tǒng)的研究結果證實,就任何一種PFAAs而言,PFAAs暴露劑量越大,造成的小鼠肝細胞DNA損傷越嚴重,PFAAs對小鼠肝細胞的毒性存在劑量-效應關系。而在相同染毒濃度下,經(jīng)過三種碳原子數(shù)不同的PFAAs暴露的研究發(fā)現(xiàn),隨著PFAAs中碳原子數(shù)目的增加,各項彗星指標值顯著增加,DNA損傷標記物8-OhdG含量測定的結果與彗星實驗一致。證實了PFAAs的碳原子數(shù)目與PFAAs的毒性作用存在正相關關系,即碳鏈越長的PFAAs毒性效應越明顯。另外,結合研究結果推斷小鼠肝細胞內的DNA損傷可能是由于PFAAs引起小鼠體內氧化應激,導致活性氧物質增加,破壞細胞內氧化還原平衡,最終誘發(fā)了DNA的損傷。第二部分：將DNA分子直接暴露于PFAAs下,通過紫外-可見吸收光譜、熒光猝滅光譜、圓二色譜、ITC、分子模擬等實驗方法和手段,在分子水平上探究PFAAs與DNA直接作用機理,建立其作用模型研究發(fā)現(xiàn),PFAAs會導致DNA發(fā)生熒光猝滅,隨著濃度的增多、碳原子數(shù)目的增加,猝滅作用越強烈。通過各種光譜學及熱力學手段,我們發(fā)現(xiàn)PFAAs與DNA傾向于以溝槽作用相結合,并可以通過氫鍵和范德華力的方式加強兩者的溝槽結合。同時隨著碳鏈長度的增長,結合作用越強。第三部分：選取與上述PFAAs具有不同官能團的FQs代表化合物ENFX,利用紫外-可見吸收光譜、熒光猝滅光譜、磷酸鹽效應和鹽效應、ITC、熒光壽命、分子模擬等研究技術和手段,在分子水平上探究ENFX與DNA作用的模式,研究發(fā)現(xiàn),DNA使具有內源熒光的ENFX發(fā)生熒光猝滅,隨著DNA濃度的增加,猝滅作用越強烈,以靜態(tài)猝滅模式發(fā)生猝滅。就結合模式而言,ENFX與DNA傾向于以嵌插作用相結合,通過氫鍵和范德華力加強相互作用,這主要與ENFX中含有平面共軛芳香環(huán)有關。本論文的研究結果表明,有機氟化合物具有明顯的基因毒性,能夠影響DNA結構和功能,毒性存在劑量-效應關系。除此之外,經(jīng)對比研究發(fā)現(xiàn),結構相似、屬于同系物的有機氟化合物的毒性主要取決于其碳原子數(shù)目,即碳原子數(shù)目越多,毒性作用越強。而結構不同的有機氟化合物,其毒性與官能團有關,官能團不同會導致有機氟化合物與DNA的作用模式不同。
【關鍵詞】：全氟化合物 氟喹諾酮 DNA 單細胞凝膠電泳 光譜技術 基因毒性
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：O621.1
【目錄】：

• 中文摘要11-13
• ABSTRACT13-15
• 符號說明15-16
• 第一章 緒論16-34
• 1.1 有機氟化合物的毒性研究進展16-22
• 1.1.1 有機氟化合物的污染研究現(xiàn)狀16-20
• 1.1.2 有機氟化合物的一般毒性機理20-22
• 1.1.2.1 全氟化合物(PFAAs)的毒性機理20-21
• 1.1.2.2 氟喹諾酮類藥物(FQs)的毒性機理21-22
• 1.1.3 有機氟化合物毒性評價中存在的問題22
• 1.2 脫氧核糖核酸(DNA)概述22-26
• 1.2.1 DNA的結構23
• 1.2.2 DNA的物理化學性質23-24
• 1.2.3 DNA與小分子的作用模式24-26
• 1.2.3.1 共價結合24-25
• 1.2.3.2 長距組裝25
• 1.2.3.3 剪切作用25
• 1.2.3.4 非共價結合25-26
• 1.3 研究方法與技術26-31
• 1.3.1 細胞水平26-28
• 1.3.1.1 細胞活力測定26-27
• 1.3.1.2 單細胞凝膠電泳技術27
• 1.3.1.3 8-OHdG測定27-28
• 1.3.1.4 細胞內活性氧(ROS)含量測定28
• 1.3.2 分子水平28-31
• 1.3.2.1 紫外-可見吸收光譜法28-29
• 1.3.2.2 熒光光譜法29
• 1.3.2.3 圓二色譜法29-30
• 1.3.2.4 時間-分辨熒光光譜法30
• 1.3.2.5 等溫量熱滴定法30
• 1.3.2.6 分子對接30-31
• 1.4 論文的研究目的、研究內容和研究意義31-34
• 1.4.1 論文的研究目的31
• 1.4.2 論文的研究內容31-32
• 1.4.3 論文的研究意義32-34
• 第二章 細胞水平上探究全氟化合物(PFPA,PFOA,PFDA)對DNA毒性作用的影響34-48
• 2.1 前言34
• 2.2 實驗部分34-40
• 2.2.1 實驗儀器34-35
• 2.2.2 實驗動物35
• 2.2.3 實驗試劑35-36
• 2.2.4 實驗方法36-40
• 2.2.4.1 肝細胞的獲取36
• 2.2.4.2 細胞的染毒與培養(yǎng)36-37
• 2.2.4.3 細胞活力測定37
• 2.2.4.4 單細胞凝膠電泳法37-38
• 2.2.4.5 細胞基因組DNA提取38
• 2.2.4.6 8-OHdG含量測定38-39
• 2.2.4.7 細胞ROS含量的測定39-40
• 2.3 結果與討論40-46
• 2.3.1 PFAAs對細胞活力影響的研究40-41
• 2.3.2 單細胞凝膠電泳41-43
• 2.3.3 PFAAs誘導細胞內8-OHdG含量變化的探究43-45
• 2.3.4 PFAAs對細胞內ROS含量變化的探究45-46
• 2.4 小結46-48
• 第三章 分子水平上探究全氟化合物(PFPA,PFOA,PFDA)對DNA毒性作用的影響48-62
• 3.1 前言48
• 3.2 實驗部分48-51
• 3.2.1 實驗儀器48-49
• 3.2.2 實驗試劑49
• 3.2.3 實驗方法49-51
• 3.2.3.1 熒光發(fā)射光譜49-50
• 3.2.3.2 紫外-可見吸收光譜50
• 3.2.3.3 圓二色譜50
• 3.2.3.4 ITC50
• 3.2.3.5 分子對接50-51
• 3.3 結果與討論51-59
• 3.3.1 紫外-可見吸收光譜51-53
• 3.3.2 熒光猝滅光譜的探究53-55
• 3.3.3 圓二色譜55-57
• 3.3.4 itc57-59
• 3.3.5 分子對接59
• 3.4 小結59-62
• 第四章 分子水平上探究恩諾沙星(ENFX)對DNA毒性作用的影響62-76
• 4.1 前言62
• 4.2 實驗部分62-65
• 4.2.1 實驗儀器62-63
• 4.2.2 實驗試劑63
• 4.2.3 實驗方法63-65
• 4.2.3.1 熒光發(fā)射光譜63-64
• 4.2.3.2 紫外-可見吸收光譜64-65
• 4.2.3.3 時間-熒光分辨光譜65
• 4.2.3.4 itc65
• 4.2.3.5 分子對接65
• 4.3 結果與討論65-74
• 4.3.1 ENFX與DNA相互作用的紫外-可見吸收光譜65-66
• 4.3.2 DNA對ENFX熒光光譜的探究66-68
• 4.3.3 以中性紅為探針,探究ENFX與DNA的結合方式68-69
• 4.3.4 磷酸鹽效應和鹽效應69-70
• 4.3.5 itc70-72
• 4.3.6 時間-分辨熒光光譜72-74
• 4.3.7 分子對接74
• 4.4 小結74-76
• 第五章 主要結論及研究展望76-80
• 5.1 主要結論76-77
• 5.1.1 細胞水平上探究PFAAs對DNA的毒性作用機理76
• 5.1.2 分子水平上探究PFAAs對DNA結構和功能的影響76-77
• 5.1.3 分子水平上探究ENFX對DNA結構和功能的影響77
• 5.2 論文的創(chuàng)新點77
• 5.3 論文不足及研究展望77-80
• 參考文獻80-88
• 致謝88-90
• 攻讀碩士學位期間的科研情況90-91
• 學位論文評閱及答辯情況表91

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