本文關(guān)鍵詞：基于RNA-Seq技術(shù)的三種抗抑郁藥對(duì)斑馬魚胚胎的早期毒性效應(yīng)研究

  更多相關(guān)文章： 抗抑郁藥 斑馬魚胚胎 RNA-Seq 差異表達(dá)基因 生態(tài)毒性

【摘要】：在全球范圍內(nèi),抗抑郁藥在藥物與個(gè)人護(hù)理用品(pharmaceutical and personal care products,PPCPs)中占有很高的比例,且在醫(yī)療行業(yè)中得到大量使用。但由于過量使用及隨意丟棄等原因,使得抗抑郁藥大量的進(jìn)入環(huán)境中,國內(nèi)外有很多文獻(xiàn)報(bào)道了抗抑郁藥在各類環(huán)境中的存在情況,特別是在水環(huán)境中的普遍存在,包括城市污廢水、飲用水、地表水及地下水,此外還有研究表明抗抑郁藥能大量富集在有機(jī)生物體中,故其對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)問題成為生態(tài)毒理研究的焦點(diǎn)。阿米替林、氟西汀和米安色林分別為三環(huán)類、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑類和四環(huán)類抗抑郁藥中的典型藥物,在水環(huán)境中均能被檢測到。本論文以模式生物斑馬魚(Danio rerio)為研究對(duì)象,阿米替林、氟西汀和米安色林為目標(biāo)藥物,利用轉(zhuǎn)錄組高通量測序(RNA-Seq)技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù),開展環(huán)境相關(guān)濃度的三種抗抑郁藥短期暴露下對(duì)斑馬魚胚胎及幼魚的早期毒性效應(yīng)研究。其主要結(jié)果如下:(1)環(huán)境污染水平下的抗抑郁藥(0.1μg/L阿米替林,10μg/L氟西汀和10μg/L米安色林)分別對(duì)斑馬魚胚胎短期(120 h)暴露后,對(duì)斑馬魚胚胎及幼魚的死亡率,斑馬魚胚胎的孵化率并沒有顯著性的影響,但抗抑郁藥暴露組的斑馬魚平均體長受到了明顯的抑制。這表明環(huán)境相關(guān)濃度下的抗抑郁藥短期暴露可顯著影響斑馬魚早期的發(fā)育。(2)利用Illumina Hiseq 2500測序平臺(tái)分別對(duì)空白對(duì)照組和三組抗抑郁藥暴露組的斑馬魚RNA樣品測序后,按照有參考基因組的數(shù)據(jù)分析方法對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行了分析,質(zhì)控后分別獲得15,557,465、14,979,480、13,716,939和15,450,283個(gè)Clean Reads數(shù),與參考序列的比對(duì)效率高達(dá)77%,此外,測序結(jié)果的飽和度很高,基本完全覆蓋樣品中所有表達(dá)的基因;通過對(duì)RNA-Seq結(jié)果中基因表達(dá)量的分析,可獲得每個(gè)處理樣品和空白對(duì)照樣品之間的顯著性差異表達(dá)基因,其中阿米替林32個(gè),氟西汀34個(gè),米安色林130個(gè),在每組差異表達(dá)基因中,上調(diào)基因個(gè)數(shù)分別為7、22和64個(gè),下調(diào)基因個(gè)數(shù)分別為25、12和66個(gè);米安色林暴露組得到的差異表達(dá)基因數(shù)目最多,其中有部分基因能夠被顯著性注釋到GO分類條目和KEGG通路中,在GO分類中主要參與應(yīng)對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng)過程、蛋白質(zhì)水解過程和多種酶活性的改變,在KEGG通路中主要參與新陳代謝途徑如檸檬酸(TCA)循環(huán)和胰島素信號(hào)通路等,表明四環(huán)類抗抑郁藥米安色林可能通過對(duì)相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控對(duì)斑馬魚胚胎產(chǎn)生毒性效應(yīng)。(3)利用RNA-Seq測序剩余的RNA樣品進(jìn)行qRT-PCR分析,結(jié)果表明所挑選的15個(gè)差異表達(dá)基因在qRT-PCR中的表達(dá)量變化結(jié)果與RNA-Seq的結(jié)果基本吻合,且結(jié)果之間具有較好的相關(guān)性,表明RNA-Seq測序數(shù)據(jù)和分析結(jié)果準(zhǔn)確可信。此外,在環(huán)境相關(guān)濃度下的抗抑郁藥(0.1,1,10μg/L的阿米替林、氟西汀和米安色林)分別對(duì)斑馬魚胚胎的短期(120 h)暴露后,利用qRT-PCR技術(shù)從基因水平研究了前列腺素D2合成酶基因(ptgdsb),雙特異性磷酸酶基因(dusp5),生物鐘相關(guān)基因nr1d1,per2,早期生長反應(yīng)蛋白基因egr1和egr4共6個(gè)差異表達(dá)基因在空白對(duì)照組和抗抑郁藥暴露組間表達(dá)量變化的濃度效應(yīng)關(guān)系,結(jié)果顯示,抗抑郁藥的短期暴露可導(dǎo)致這6個(gè)基因的表達(dá)受到抑制,暗示抗抑郁藥可能通過影響斑馬魚的神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)而抑制ptgdsb的表達(dá),或通過降低dusp5的表達(dá)促進(jìn)斑馬魚細(xì)胞的凋亡;此外,抗抑郁藥還可能通過抑制nr1d1和per2的表達(dá)改變斑馬魚的生理節(jié)律狀況,或通過改變?cè)缙谏L反應(yīng)蛋白基因egr1和egr4的表達(dá)從而對(duì)斑馬魚的早期發(fā)育產(chǎn)生毒性效應(yīng)。綜上,本論文的研究結(jié)果揭示了三種不同類型的抗抑郁藥污染物的短期水體暴露對(duì)斑馬魚胚胎的早期生長發(fā)育都具有顯著的毒性效應(yīng)。三種抗抑郁藥對(duì)斑馬魚胚胎的毒性效應(yīng)具有一定的相似性,表現(xiàn)在顯著的抑制斑馬魚幼魚的體長,調(diào)控幼魚體內(nèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,暗示低劑量抗抑郁藥類污染物的水體長期暴露可能影響魚類早期胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)發(fā)育及其生理節(jié)律,從而對(duì)魚類的個(gè)體發(fā)育以及種群發(fā)展產(chǎn)生一定的毒害效應(yīng)。因此,本論文研究結(jié)果為評(píng)價(jià)藥物類新型有機(jī)污染物對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)與機(jī)理提供了充足的證據(jù),也提示我們水體中藥物類污染物的生態(tài)毒性和風(fēng)險(xiǎn)問題亟待重視。
【關(guān)鍵詞】：抗抑郁藥 斑馬魚胚胎 RNA-Seq 差異表達(dá)基因 生態(tài)毒性
【學(xué)位授予單位】：上海大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：X171.5
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 緒論14-31
• 1.1 抗抑郁藥概述14-17
• 1.1.1 抗抑郁藥的使用現(xiàn)狀14-15
• 1.1.2 抗抑郁藥種類15-17
• 1.2 阿米替林、氟西汀和米安色林概述17-21
• 1.2.1 阿米替林、氟西汀和米安色林簡介17
• 1.2.2 阿米替林、氟西汀和米安色林在環(huán)境中的分布17-21
• 1.3 阿米替林、氟西汀和米安色林的生物毒性研究現(xiàn)狀21-22
• 1.3.1 行為及生殖能力21
• 1.3.2 神經(jīng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)21-22
• 1.3.3 免疫系統(tǒng)22
• 1.4 RNA-Seq技術(shù)22-26
• 1.4.1 測序技術(shù)的發(fā)展歷程23
• 1.4.2 RNA-Seq技術(shù)概述23-25
• 1.4.3 RNA-Seq技術(shù)在差異表達(dá)基因研究方面的優(yōu)勢(shì)25-26
• 1.5 研究目的與意義26-27
• 1.5.1 斑馬魚的選取26
• 1.5.2 本研究的目的和意義26-27
• 1.6 研究內(nèi)容和技術(shù)路線圖27-30
• 1.7 課題來源30-31
• 第二章 抗抑郁藥暴露對(duì)斑馬魚胚胎生長發(fā)育指標(biāo)的影響31-45
• 2.1 材料與方法31-36
• 2.1.1 主要儀器與設(shè)備31-32
• 2.1.2 主要藥品及試劑32
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件32
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)32-33
• 2.1.5 樣品采集33
• 2.1.6 總RNA提取33-36
• 2.1.7 數(shù)據(jù)處理36
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論36-44
• 2.2.1 斑馬魚胚胎發(fā)育情況36
• 2.2.2 斑馬魚胚胎孵化率36-37
• 2.2.3 斑馬魚胚胎存活率37-38
• 2.2.4 斑馬魚幼魚體長38-40
• 2.2.5 斑馬魚幼魚RNA樣品40-44
• 2.3 本章小結(jié)44-45
• 第三章 斑馬魚胚胎在抗抑郁藥暴露后的RNA-Seq分析45-65
• 3.1 實(shí)驗(yàn)流程及分析方法45-50
• 3.1.1 RNA-Seq測序?qū)嶒?yàn)流程45-46
• 3.1.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制46-47
• 3.1.3 RNA-Seq數(shù)據(jù)與參考基因組序列比對(duì)47
• 3.1.4 RNA-Seq文庫質(zhì)量評(píng)估47-48
• 3.1.5 基因表達(dá)量分析48
• 3.1.6 差異表達(dá)基因篩選分析48-49
• 3.1.7 差異表達(dá)基因GO分類49
• 3.1.8 差異表達(dá)基因KEGG注釋49-50
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論50-63
• 3.2.1 測序數(shù)據(jù)及其質(zhì)量控制50-51
• 3.2.2 RNA-Seq數(shù)據(jù)與參考基因組序列比對(duì)51-53
• 3.2.3 RNA-Seq文庫質(zhì)量評(píng)估53-55
• 3.2.4 基因表達(dá)量分析55-57
• 3.2.5 差異表達(dá)基因篩選分析57-61
• 3.2.6 差異表達(dá)基因GO分類61-63
• 3.2.7 差異表達(dá)基因KEGG注釋63
• 3.3 本章小結(jié)63-65
• 第四章 RNA-Seq差異表達(dá)基因的驗(yàn)證及分析65-91
• 4.1 材料與方法65-73
• 4.1.1 主要儀器與設(shè)備65
• 4.1.2 主要藥品及試劑65-66
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件66
• 4.1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)66
• 4.1.5 樣品采集66
• 4.1.6 總RNA提取66-68
• 4.1.7 cDNA模板合成68
• 4.1.8 基因引物驗(yàn)證68-72
• 4.1.9 抗抑郁藥暴露后基因qRT-PCR分析72-73
• 4.1.10 數(shù)據(jù)處理73
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論73-90
• 4.2.1 斑馬魚胚胎或幼魚生理指標(biāo)73-74
• 4.2.2 斑馬魚幼魚RNA樣品74-75
• 4.2.3 目的基因引物驗(yàn)證75-80
• 4.2.4 RNA-Seq測序結(jié)果中差異表達(dá)基因的驗(yàn)證80-85
• 4.2.5 抗抑郁藥暴露對(duì)斑馬魚幼魚的毒性評(píng)價(jià)85-90
• 4.3 本章小結(jié)90-91
• 第五章 結(jié)論與展望91-94
• 5.1 研究結(jié)論91-92
• 5.2 研究展望92-94
• 參考文獻(xiàn)94-102
• 參與課題與科研成果102-104
• 致謝104-105

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本文編號(hào)：898115