本文關鍵詞：白淺灰鏈霉菌對聚乙烯降解效果研究及降解酶的基因克隆

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【摘要】：近幾年工業(yè)的迅速發(fā)展帶來了嚴重的“白色污染”問題,影響著我們的生產(chǎn)與生活,在眾多緩解“白色污染”、處理廢棄塑料的方法中,利用微生物降解塑料成為熱門研究領域之一。本試驗首先從土壤中篩選、分離出一株能夠降解聚乙烯的放線菌,通過進行菌落形狀、大小、顏色等形態(tài)學的觀察、生理生化鑒定和16S r DNA的全序列克隆測序,鑒定其為Streptomyces albogriseolus白淺灰鏈霉菌。其次初探白淺灰鏈霉菌對聚乙烯的降解效果研究:(1)對相對分子量分別為2000、5000、10W和40W的聚乙烯粉末進行研究,結果表明不同分子量的聚乙烯粉末都可以被白淺灰鏈霉菌降解,且降解程度從大到小依次為:2000500010W40W;(2)對相對分子質量100W的聚乙烯膜片進行研究,結果表明白淺灰鏈霉菌附著在聚乙烯膜片上進行生長且在肉眼和掃描電子顯微鏡下觀察均發(fā)現(xiàn)膜片表面有破損和孔洞,由此說明聚乙烯膜片也可以被白淺灰鏈霉菌所降解。所以可知白淺灰鏈霉菌不僅屬于低分子量聚乙烯降解菌,也屬于高分子量甚至超高分子量降解菌。再次探究白淺灰鏈霉菌降解聚乙烯的關鍵酶:先用漆酶和HBT(1-羥基苯并三唑)構建了一個中間體或介導體,在30℃的環(huán)境中降解相對分子質量為2000的聚乙烯粉末,在3 d以后可以看到實驗組的聚乙烯粉末顆粒變小,溶液呈淺黃色。根據(jù)有關文獻和實驗結果表明漆酶是降解聚乙烯的關鍵酶。利用ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)法檢測白淺灰鏈霉菌發(fā)酵液中含有漆酶蛋白且測定其酶活。比較NCBI gene數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的鏈霉菌漆酶基因序列,設計引物K-F2、K-R2,利用PCR技術體外擴增出白淺灰鏈霉菌基因組DNA中的漆酶基因,進行BLAST比對與分析。將得到的漆酶基因與克隆質粒p EASY-T1 Cloning Vector連接,構建了重組克隆質粒p EASY-T1 Cloning Vector/laccase,導入到感受態(tài)細胞Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell中并進行陽性克隆驗證。采用限制性內切酶XhoⅠ和Bam HⅠ對重組克隆質粒p EASY-T1 Cloning Vector/laccase與原核表達載體p ET-32a-c(+)Vector進行雙酶切,露出粘性末端,采用T4 DNA Ligase進行連接,導入到感受態(tài)細胞中BL21(DE3)Chemically Competent Cell中并進行陽性克隆驗證。最后,將攜帶有重組表達質粒的大腸桿菌BL21(DE3)進行檢測:(1)將其接種在聚乙烯為唯一碳源和能源的基礎無碳源固體培養(yǎng)基上進行生長,結果顯示有菌落長出,說明大腸桿菌BL21(DE3)可以利用聚乙烯粉末;(2)將攜帶p ET-32a-c(+)Vector/laccase的大腸桿菌BL21(DE3)的發(fā)酵液用硫酸銨分級沉淀制成粗酶液,用SDS-PAGE檢測到粗酶液中含有漆酶蛋白且分子量大小約為66.4 KDa。通過一系列的基因克隆技術,將白淺灰鏈霉菌中的漆酶基因導入到大腸桿菌中并表達成功。說明漆酶是降解聚乙烯的關鍵酶,這將為以后探索微生物對聚乙烯降解機制、篩選漆酶高產(chǎn)菌株奠定了基礎。
【關鍵詞】：基因克隆 聚乙烯粉末 漆酶基因 白淺灰鏈霉菌 基因組DNA
【學位授予單位】：四川師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;X172
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 緒論10-18
• 1.1 課題背景10-11
• 1.1.1 課題來源10
• 1.1.2 課題的目的和意義10
• 1.1.3 課題的研究內容及創(chuàng)新點10-11
• 1.2 聚乙烯降解的研究概況11-14
• 1.2.1 聚乙烯的定義與分類11-12
• 1.2.2 聚乙烯研究背景12-13
• 1.2.3 目前所用降解菌的種類13
• 1.2.4 聚乙烯生物降解國內外研究情況對比13-14
• 1.2.5 發(fā)展前景及方向14
• 1.3 漆酶的研究概況14-18
• 1.3.1 漆酶的分布14-15
• 1.3.2 漆酶的理化性質15-16
• 1.3.3 漆酶的應用16-18
• 2 白淺灰鏈霉菌對聚乙烯的降解效果研究18-33
• 2.1 實驗材料18-20
• 2.1.1 實驗儀器18-19
• 2.1.2 培養(yǎng)基19
• 2.1.3 藥品及試劑19-20
• 2.1.4 菌種20
• 2.2 實驗方法20-23
• 2.2.1 聚乙烯降解菌株篩選方法20-22
• 2.2.2 菌株F1對聚乙烯降解能力的初探22-23
• 2.3 結果與討論23-31
• 2.3.1 菌株F1的篩選與分離23
• 2.3.2 菌株F1的鑒定23-29
• 2.3.3 菌株F1對聚乙烯降解能力的初探29-31
• 2.4 結論31-33
• 3 白淺灰鏈霉菌漆酶基因的克隆33-67
• 3.1 實驗材料33-38
• 3.1.1 菌種與載體33-34
• 3.1.2 實驗試劑34-36
• 3.1.3 培養(yǎng)基36
• 3.1.4 實驗儀器36-37
• 3.1.5 引物37-38
• 3.2 實驗方法38-48
• 3.2.1 漆酶降解聚乙烯粉末38
• 3.2.2 白淺灰鏈霉菌發(fā)酵液中漆酶的檢測及其活性的測定38
• 3.2.3 漆酶基因的克隆38-45
• 3.2.4 攜帶有重組表達質粒的大腸桿菌BL21(DE3)中漆酶的檢測45-48
• 3.3 結果與討論48-66
• 3.3.1 漆酶降解聚乙烯粉末48-49
• 3.3.2 白淺灰鏈霉菌發(fā)酵液中漆酶的檢測及其活性的測定49-51
• 3.3.3 漆酶基因的克隆51-62
• 3.3.4 攜帶有重組表達質粒的大腸桿菌BL21(DE3)中漆酶的檢測62-66
• 3.4 結論66-67
• 總結與展望67-69
• 參考文獻69-86
• 附錄86-89
• 致謝89

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1 古靜燕,劉紅兵,崔承彬,顧謙群;海洋來源白淺灰鏈霉菌中環(huán)二肽類化合物的分離與結構鑒定[J];中國海洋大學學報(自然科學版);2005年04期

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本文編號：593892