發(fā)布時間：2020-09-24 13:51

　　 隨著現(xiàn)代工業(yè)發(fā)展和世界人口的不斷增長,礦石及其它來源的重金屬逐漸流入周邊環(huán)境,不斷對土壤、水體及空氣造成嚴重污染。重金屬污染直接影響了植物尤其是作物的生長,造成農(nóng)作物減產(chǎn)。然而,人們對植物響應重金屬脅迫機制的關(guān)注遠遠不夠。為確保合理利用植物進行重金屬污染治理,亟待更多抗重金屬相關(guān)機制的深入研究。實驗室前期以普通小麥濟南177(JN177)和長穗偃麥草為親本,通過非對稱體細胞雜交的技術(shù),選育出耐鹽堿小麥漸滲系新品種—山融4號(SR4)。利用第二代高通量測序技術(shù)從SR4耐鹽堿轉(zhuǎn)錄組中克隆了一個受誘導上調(diào)表達的小麥谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因TaGSTF3,其開放閱讀框全長約669 bp。將該基因構(gòu)建入雙子葉植物表達載體pRI101-AN。以農(nóng)桿菌介導的花器官浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥Col-0,獲得了兩個轉(zhuǎn)TaGSTF3擬南芥過表達株系。研究發(fā)現(xiàn)異源過表達TaGSTF3基因的擬南芥并未表現(xiàn)出抗鹽堿旱等逆境脅迫的功能。但經(jīng)重金屬硝酸鉛Pb(N03)2和硫酸鎳NiSO4處理后,TaGSTF3過表達擬南芥表現(xiàn)出對Pb2+和Ni2+的脅迫抗性。據(jù)此,本論文通過對過表達TaGSTF3擬南芥表型、功能等的初步探究,發(fā)現(xiàn)了TaGSTF3響應Pb2+和Ni2+的可能機制。1、過表達TaGSTF3擬南芥的鉛耐受性分析在培養(yǎng)皿生長條件下,鉛Pb2+脅迫處理后,過表達系相較野生型地上部更大,根系更長更發(fā)達;生長在土壤中的過表達系,經(jīng)鉛Pb2+脅迫處理后,表現(xiàn)出比野生型更明顯的生長遲緩,植株矮小,所結(jié)莢果少的表型。通過對培養(yǎng)皿中生長的WT、OE1和OE2植株鮮重統(tǒng)計,葉綠素含量、丙二醛含量、總谷胱甘肽含量及ROS清除酶活力測定,結(jié)果顯示,與野生型相比兩個過表達系經(jīng)鉛(Pb2+)脅迫處理后,其鮮重、總?cè)~綠素含量、總谷胱甘肽含量、POD酶活力更高;丙二醛含量及SOD酶活力則顯著低于野生型,表現(xiàn)出更高的耐鉛Pb2+脅迫能力。DAB和NBT染色結(jié)果顯示轉(zhuǎn)TaGSTF3過表達系積累的ROS更少。ROS相關(guān)Marker genes表達分析顯示,經(jīng)鉛Pb2+脅迫處理后過表達系ROS合成相關(guān)Marker genes表達量顯著低于野生型,ROS清除相關(guān)Marker genes表達量顯著高于野生型。鉛脅迫相關(guān)基因AtATM3、AtPDR12和AtGSH1的表達分析結(jié)果顯示TaGSTF3可能通過AtATM3和AtGSH1調(diào)控對鉛Pb2+的耐受性。利用GSH合成抑制劑BSO(丁硫氨酸-亞砜亞胺)對過表達系的抑制結(jié)果表明,轉(zhuǎn)TaGSTF3擬南芥對鉛Pb2+的耐受性依賴于GSH。綜上,轉(zhuǎn)TaGSTF3擬南芥響應鉛Pb2+的機制可能與依賴GSH的代謝途徑及ROS信號通路有關(guān)。2、過表達TaGSTF3擬南芥的鎳耐受性分析培養(yǎng)皿生長條件下,鎳Ni2+脅迫處理后,過表達系相較野生型地上部更大,根系更長更發(fā)達;土壤生長條件下,鎳Ni2+脅迫處理后,過表達系和野生型均表現(xiàn)出地上部青枯,葉片褪綠、黃化,但是過表達系較野生型葉片更綠。通過對培養(yǎng)皿生長條件下的WT、OE1和OE2植株鮮重統(tǒng)計,葉綠素、丙二醛和總谷胱甘肽含量測定及ROS合成和清除酶活力測定,結(jié)果顯示經(jīng)鎳Ni2+脅迫處理,兩個過表達系植株鮮重更高,總?cè)~綠素、丙二醛、SOD酶活力、POD酶活力及總谷胱甘肽含量顯著高于野生型,表現(xiàn)出對鎳Ni2+脅迫更高的耐受能力。DAB和NBT染色結(jié)果顯示轉(zhuǎn)TaGSTF3過表達系積累的ROS更少。ROS相關(guān)Marker genes表達分析顯示過表達系植株在鎳Ni2+脅迫處理后ROS合成相關(guān)Marker genes表達量顯著低于野生型,ROS清除相關(guān)Marker genes表達量顯著高于野生型。以GSH合成抑制劑BSO處理結(jié)果表明,轉(zhuǎn)TaGSTF3擬南芥對鎳Ni2+的耐受性依賴于GSH。綜上,轉(zhuǎn)TaGSTF3擬南芥耐鎳Ni2+的響應機制可能與依賴GSH的代謝途徑有關(guān)。ROS信號通路亦可能在TaGSTF3介導的耐受重金屬鎳機制中發(fā)揮重要作用。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：X503.23;Q945.78
【部分圖文】：

（ＸｉａｎｇｅｔａＬ，２００１），推測可能是因為僅憑ＧＳＨ并不足以支撐植物耐受重金逡逑屬的復雜機制（ＮｏｃｔｏｒｅｔａＬ，邋１９９８）。Ｙａｄａｖ等（２０１０）總結(jié)了植物耐受重金屬逡逑脅迫可能的三個路徑（如圖１．５）邋：邋１、通過螯合重金屬離子將其從質(zhì)膜栗出，逡逑將重金屬與細胞質(zhì)中各種含巰基的化合物連接然后轉(zhuǎn)運隔離到液泡中。２、其他逡逑抗氧化和修復機制可能也參與耐受過程。Ｐｉｅｃｈａｌａｋ等（２００２）研宄發(fā)現(xiàn)，ＰＣｓ會逡逑響應鉛脅迫而合成并形成ＰＣ－Ｐｂ復合物，但是這個復合物向液泡的轉(zhuǎn)運并不清逡逑楚。在擬南芥中的研宄發(fā)現(xiàn)ＰＣｓ要在根系和地上部分之間經(jīng)過長距離的運輸，逡逑Ｍｅｎｄｏｚａ－Ｃｏｚａｔｌ等（２００８）的研宄表明ＰＣｓ和ＧＳＨ可作為Ｃｄ長距離運輸?shù)腻义陷d體（形成ＰＣ－Ｃｄ或ＧＳＨ－Ｃｄ復合物）。然而，關(guān)于ＧＳＨ－Ｍ復合物的跨膜逡逑運輸目前知之甚少。己知一種擬南芥線粒體蛋白、ＡＴＰ結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白ＡｔＡＩＭ３，逡逑１０逡逑

TaGSTF3蛋白結(jié)構(gòu)分析

通過ＮＣＢＩＢｌａｓｔｐ程序比對ＴａＧＳＴＦ３與其他幾種植物的氨基酸序列，結(jié)果逡逑，ＴａＧＳＴＦ３邋與玉米邋ＧＳＴ８邋（ＡＡＧ３４８１６．１）、大麥邋ＧＳＴ邋（ＣＡＤ１１９６６．１）、逡逑邋ＧＳＴ２１邋（ＮＰ＿００１２９１４４６．１）和擬南芥邋ＧＳＴ邋（ＮＰ＿１９１８３５．１）氨基酸序列一逡逑分別為６４％、５８％、５１％和５０％。利用Ｃｌｕｓｔａｌｘ軟件多序列比對分析可逡逑不同物種中ＧＳＴ蛋白序列相對比較保守（圖３．４Ａ）。利用ＭＥＧＡ５．１軟逡逑小麥谷觥甘肽轉(zhuǎn)移酶ＴａＧＳＴＦ３進行了系統(tǒng)發(fā)育分析（圖３．４邋Ｂ）。分析顯逡逑在進化過程中ＴａＧＳＴＦ３蛋白與短柄草而ｔｏｃ／７＞ｗｗ）的親緣逡逑較近，而與擬南芥（也0６／￡／0；？７＿５／／７0／／（皿７）較遠。逡逑

【參考文獻】

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本文編號：2825804