養(yǎng)殖水環(huán)境中孔雀石綠殘留導(dǎo)致水產(chǎn)品中孔雀石綠超標(biāo)問題時(shí)有發(fā)生,嚴(yán)重影響人體健康。利用微生物降解水環(huán)境中孔雀石綠的應(yīng)用前景廣闊,本文篩選并鑒定具有高效孔雀石綠降解能力的菌株,系統(tǒng)研究菌株的孔雀石綠降解特性,利用RNA-Seq技術(shù)篩選孔雀石綠抗性和降解相關(guān)的關(guān)鍵基因和代謝通路,在轉(zhuǎn)錄組水平上初步揭示菌株的孔雀石綠降解機(jī)理。目前,還沒有成熟的方法用于解決水環(huán)境中孔雀石綠超標(biāo)問題。本研究的開展不僅為微生物孔雀石綠降解基因的篩選和降解機(jī)理的研究提供重要參考,同時(shí)為孔雀石綠降解微生物和酶制劑的開發(fā)和利用奠定重要理論基礎(chǔ)。1.采用硼氫化鉀還原-高效液相色譜法檢測(cè)樣品中的孔雀石綠�？兹甘G加標(biāo)濃度在1mg·L~(-1)~20 mg·L~(-1)內(nèi),該方法的回收率為88.357%~94.135%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.035%~2.599%,符合檢測(cè)要求。從長期受孔雀石綠污染的養(yǎng)殖池塘底泥中篩選分離到2株能夠高效降解孔雀石綠的菌株,分別命名為WA-1和B-20。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),在LB培養(yǎng)基中,菌株WA-1和B-20對(duì)20 mg·L~(-1)孔雀石綠在24 h內(nèi)的降解率分別為99.8%和97.2%。經(jīng)API 20E鑒定卡和VITEK 2 GN微生物鑒定系統(tǒng)及16S rRNA序列初步鑒定發(fā)現(xiàn),菌株WA-1為克雷伯氏菌屬,重新命名為Klebsiella sp.WA-1,菌株B-20為腸桿菌屬,重新命名為Enterobacter sp.B-20。2.Enterobacter sp.B-20在LB培養(yǎng)基中對(duì)1~40 mg·L~(-1)孔雀石綠有較強(qiáng)的降解能力。Enterobacter sp.B-20在12 h內(nèi)對(duì)1 mg·L~(-1)降解率達(dá)到92.2%,對(duì)5~40 mg·L~(-1)孔雀石綠的降解率均超過82.4%,24 h內(nèi)對(duì)5~20 mg·L~(-1)孔雀石綠降解率均超過97.1%。Enterobacter sp.B-20的孔雀石綠降解率隨著pH的增加而顯著提高,最適降解pH為9。同時(shí)Enterobacter sp.B-20具有較強(qiáng)的耐鹽性,在1%~4%的NaCl濃度具有穩(wěn)定的孔雀石綠降解特性。Enterobacter sp.B-20在0.1~2 mmol·L~(-1) Zn~(2+)、Fe~(3+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Mg~(2+)、Pb~(2+)和Ca~(2+)等金屬離子條件下表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐性及穩(wěn)定的孔雀石綠降解能力,而且0.1~1 mmol·L~-11 Fe~(3+)、0.1~0.5 mmol·L~-11 Cu~(2+)、0.1 mmol·L~-11 Mn~(2+)、0.1~1 mmol·L~-11 Pb~(2+)均能顯著提高菌株的孔雀石綠降解率。3.Klebsiella sp.WA-1能夠在不需要任何無機(jī)或有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)條件下發(fā)揮孔雀石綠降解作用。Klebsiella sp.WA-1對(duì)水溶液中1~40 mg·L~(-1)孔雀石綠降解能力較強(qiáng),在0.5 h內(nèi)對(duì)1~20 mg·L~(-1)孔雀石綠的降解率均超過94.0%,12 h內(nèi)對(duì)1~40 mg·L~(-1)孔雀石綠的降解率超過94.4%。Klebsiella sp.WA-1的孔雀石綠降解率隨著pH值的升高而逐漸增加,這種增加作用主要由于高pH值下孔雀石綠發(fā)生自然降解作用。Klebsiella sp.WA-1在1%~4%的NaCl濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出穩(wěn)定的孔雀石綠降解特性,12 h內(nèi)對(duì)5 mg·L~(-1)和40 mg·L~(-1)孔雀石綠的降解率均達(dá)到97.0%和94.0%以上。Klebsiella sp.WA-1的最適孔雀石綠降解溫度為37℃,高溫條件較低溫條件更適宜于該菌發(fā)揮孔雀石降解作用。在添加0.1~1 mmol·L~(-1) Zn~(2+)、Fe~(3+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Mg~(2+)、Pb~(2+)和Ca~(2+)等金屬離子條件下Klebsiella sp.WA-1表現(xiàn)出較穩(wěn)定的孔雀石綠降解能力。添加0.1~0.5 mmol·L~(-1) Mn~(2+)、0.1~1 mmol·L~(-1) Mg~(2+)、0.1 mmol·L~(-1) Cu~(2+)能夠顯著提高Klebsiella sp.WA-1的孔雀石綠降解能力。4.采用RNA-Seq技術(shù)研究菌株Enterobacter sp.B-20在不同濃度孔雀石綠作用下基因表達(dá)差異,選擇FPKM值為2倍差異變化且Adjusted P-value0.05的基因作為差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集和KEGG通路富集分析。CK組與M5組共篩選出差異表達(dá)基因115個(gè),與CK組相比,M5組上調(diào)和下降的顯著差異基因分別為80和35個(gè)。CK組與M20組共篩選出差異表達(dá)基因466個(gè),M20組上調(diào)和下降的顯著差異基因分別為229和237個(gè)。篩選出多種與孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物抗性和降解相關(guān)的關(guān)鍵基因和代謝通路:多種運(yùn)輸糖類等環(huán)狀化合物的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能涉及孔雀石綠的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn);多種ABC、MFS、RND轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的藥物外排蛋白對(duì)于Enterobacter sp.B-20的孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物抗性有重要作用;多種三苯甲烷還原酶和芳香族化合物降解相關(guān)基因在孔雀石綠誘導(dǎo)下顯著表達(dá),表明這些基因在Enterobacter sp.B-20孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物降解上發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位單位】：大連海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：X172
【部分圖文】：

餉蛐蛄杏?WA-1 的 16S rRNA 基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2-3)。經(jīng)計(jì)算，菌株 WA-1 16S rRNA 基因序列與 Klebsiella pneumoniae subsp.rhionscleromatisATCC13884 標(biāo)準(zhǔn)菌株最為相似，兩者同源性為 99%，由此初步確定所分離的孔雀石綠降解菌株 WA-1 為 Klebsiella sp.。Enterobacter asburiae JCM 6051 BBED01000197Enterobacter bugandensis EB-247 HQ122932Enterobacter cancerogenus LMG 2693 Z96078Enterobacter aerogenes KCTC 2190 CP002824Enterobacter soli ATCC BAA-2102 LXES01000062Enterobacter ludwigii EN-119 JTLO01000001Enterobacter kobei DSM 13645 CP017181Enterobacter cloacae subsp. dissolvens LMG 2683 Z96079Enterobacter cloacae subsp. cloacae ATCC 13047 CP001918Enterobacter siamensis C2361 HQ888848Enterobacter sp. B-20Enterobacter muelleri JM-458 KP345900Enterobacter tabaci YIM Hb-3 KP990658Enterobacter mori LMG 25706 GL890774Enterobacter hormaechei subsp. hormaechei ATCC 49162 AFHR01000079Enterobacter hormaechei subsp. oharae DSM 16687 CP017180Enterobacter xiangfangensis 10-17 HF679035Enterobacter hormaechei subsp. steigerwaltii DSM 16691 CP017179Enterobacter massiliensis JC163 CAEO0100017136918569

菌體用蒸餾水洗滌 2 次，80 ℃烘至恒重后稱重，計(jì)算生物分析驗(yàn)處理重復(fù) 3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用 SPSS因素方差分析（One-WayANOVA），應(yīng)用多重比較 Tukey 檢測(cè)對(duì)各異性進(jìn)行檢驗(yàn)，不含有相同字母表示組間差異顯著：生物量間差異.05；孔雀石綠降解率間差異用小寫字母表示，P<0.05，“*”表示與P<0.05。結(jié)果與討論erobacter sp.B-20 孔雀石綠降解動(dòng)力學(xué)曲線bacter sp.B-20 對(duì)不同濃度孔雀石綠（5~20 mg·L-1）的降解動(dòng)力學(xué)曲

濃度孔雀石綠條件下降解孔雀石綠的應(yīng)用前景。雀石綠初始濃度對(duì) Enterobacter sp.B-20 孔雀石綠降解的影響孔雀石綠濃度（1~40 mg·L-1）對(duì) Enterobacter sp.B-20 的生長和孔雀石2。與正常培養(yǎng)組相比，孔雀石綠（5~40 mg·L-1）的添加顯著抑制了菌石綠對(duì)菌株有一定毒害作用。與菌株生物量變化相似，菌株的孔雀石綠濃度的升高呈逐漸下降的趨勢(shì)�？兹甘G濃度為 1 mg·L-1時(shí)菌株的）；孔雀石綠濃度升高到 40 mg·L-1時(shí)，孔雀石綠的降解效果相對(duì)較低 82.4%。

【參考文獻(xiàn)】

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