水是生命之源,水質(zhì)安全尤為重要,而環(huán)境雌激素逐漸成為引發(fā)水源化學(xué)性污染的重要原因。雙酚A(bisphenol A,BPA)和雌二醇(estradiol,E2)作為典型的環(huán)境雌激素,因其危害范圍廣、影響時(shí)間長(zhǎng)而被廣泛關(guān)注,故亟待建立快速、簡(jiǎn)便、高效檢測(cè)這兩種物質(zhì)的方法。目的本研究以BPA和E2兩種典型環(huán)境雌激素為研究對(duì)象,基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)、生物傳感技術(shù)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)構(gòu)建兩種高效檢測(cè)BPA和E2的傳感技術(shù)體系。方法1.基于上轉(zhuǎn)換熒光探針和FRET檢測(cè)水中BPA。利用改進(jìn)的溶劑熱法合成上轉(zhuǎn)換納米顆粒(upconversion nanoparticles,UCNPs:NaYF_4:Yb~(3+),Er~(3+)),用透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)和傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)等方法表征顆粒。對(duì)UCNPs表面修飾制備熒光探針,其可與標(biāo)記熒光基團(tuán)的適配體實(shí)現(xiàn)FRET,隨著體系中BPA濃度的升高,熒光強(qiáng)度值的變化與之呈現(xiàn)相應(yīng)的線(xiàn)性關(guān)系。2.基于AuNP-AuNP-UCNP三聯(lián)體結(jié)構(gòu)的傳感體系高效檢測(cè)BPA和E2。以納米金(gold nanoparticles,AuNPs)和上轉(zhuǎn)換顆粒(NaYF_4:Yb,Er,Gd UCNPs)為光學(xué)探針,二者分別連接BPA和E2的適配體,經(jīng)總互補(bǔ)序列連接形成AuNP-AuNP-UCNP三聯(lián)體結(jié)構(gòu),當(dāng)加入BPA或E2時(shí),由于適配體和小分子之間的特異性結(jié)合,連接有適配體的AuNPs或UCNPs從三聯(lián)體結(jié)構(gòu)脫落,經(jīng)過(guò)離心測(cè)上清液中UCNPs熒光強(qiáng)度和沉淀中金納米可見(jiàn)吸收強(qiáng)度的變化同時(shí)檢測(cè)BPA和E2。結(jié)果1.基于上轉(zhuǎn)換熒光探針和FRET檢測(cè)水中痕量BPA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:實(shí)驗(yàn)用NaYF_4:Yb~(3+),Er~(3+)UCNPs為六方相且分散均勻,其平均直徑約為73 nm,表面包覆6 nm的硅層。在優(yōu)化的反應(yīng)條件下,BPA濃度在0.1 ng/mL~25 ng/mL與熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系(R~2=0.9938),檢出限達(dá)到0.05 ng/mL。天津海河水的加標(biāo)回收率在91.00%~108.60%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差4.5%。2.基于AuNP-AuNP-UCNP三聯(lián)體結(jié)構(gòu)的傳感體系高效檢測(cè)BPA和E2的結(jié)果:在反應(yīng)溫度為30℃,pH 7.8時(shí),本方法檢測(cè)BPA和E2的線(xiàn)性范圍分別為2 ng/mL~200 ng/mL和10 ng/mL~150 ng/mL,檢出限分別為0.2 ng/mL和0.5ng/mL。本方法用于實(shí)際水樣中的加標(biāo)回收率均在86.07%~107.35%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差6.8%,三聯(lián)體結(jié)構(gòu)可在4℃保存9天,檢測(cè)方法穩(wěn)定可靠。結(jié)論本文成功構(gòu)建了兩種生物傳感技術(shù)體系用于BPA和E2的檢測(cè),檢測(cè)方法靈敏度高、準(zhǔn)確高效、簡(jiǎn)單實(shí)用。本研究在一定程度上為EEs的快速檢測(cè)提供了技術(shù)支持,具有較好的理論價(jià)值和應(yīng)用前景。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R123.1;TP212
【部分圖文】：

實(shí)驗(yàn)原理如圖2.1 所示：首先合成裸的 UCNPs，再對(duì)其表面進(jìn)行包硅殼和氨基修飾，之后在其表面修飾 SA，通過(guò)生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)連接 BPA 適配體，然后在體系加入 TAMRA 修飾的互補(bǔ)鏈，此時(shí)由于堿基互補(bǔ)配對(duì)使 UCNPs 和 TAMRA 距離拉近，而 UCNPs 的熒光光譜和 TAMRA 的吸收光譜有一定的重疊（見(jiàn)圖 2.2），符合發(fā)生 FRET 現(xiàn)象的條件，致使 UCNPs 熒光猝滅

上轉(zhuǎn)換納米顆粒的合成根據(jù)傳統(tǒng)溶劑熱法，經(jīng)過(guò)改變實(shí)驗(yàn)條件制備了四組 UCNPs，并根據(jù)其后的熒光強(qiáng)度變化，選擇熒光發(fā)光效率最強(qiáng)的一組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，具件見(jiàn)表 2.4。表 2. 4 UCNPs 合成的實(shí)驗(yàn)條件組別摩爾比(Y: Yb: Er)反應(yīng)溫度（℃）反應(yīng)時(shí)間（min）包硅時(shí)間（h）A 80:18:2 250 60 6B 80:18:2 250 90 6圖 2. 2 UCNPs 和 TAMRA 的光譜重疊效果圖注：a) UCNPs 的熒光光譜； b) TAMRA 的吸收光譜

.3.2 納米探針的制備為了驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)所用適配體與小分子的特異性結(jié)合效果，用圓二色Circular Dichroism，CD）考察適配體結(jié)合目標(biāo)物前后的構(gòu)型變化，間接證者的有效結(jié)合。使用前將生工合成的兩種適配體用 PBS 稀釋到 10 μmol/L，℃下加熱 5 min，后在冰水浴中冷卻備用。參照文獻(xiàn)[59]中的方法合成膠體金，4℃避光條件下保存?zhèn)溆�。將膠體金分巰基修飾的 E2 適配體和巰基修飾的總互補(bǔ)鏈 cDNA 以摩爾比 1:100 混合， 50 mmol/L 的 NaCl，將體系置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱 25℃下孵育 12 h。反應(yīng)結(jié) 13000 r/min 離心 15 min，清洗，將所得沉淀重懸在 1×TBE 緩沖液中，即可 cDNA 和 E2 適配體修飾的金納米探針，4℃避光保存?zhèn)溆�。參照文獻(xiàn)[60]中的方法合成上轉(zhuǎn)換納米顆粒。為使顆粒連接上適配體，先圖 2. 3 三聯(lián)體結(jié)構(gòu)傳感體系檢測(cè)原理圖

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2809155