【摘要】：近年來,污水中排放的含氮物質(zhì)是導致水體富營養(yǎng)化嚴重污染的主要因素,引起了人們的廣泛關注。氮去除是污水處理過程中的重要環(huán)節(jié),傳統(tǒng)的硝化-反硝化處理模式,由于其反硝化過程緩慢,需要分離硝化和反硝化反應器,具有成本較高,實現(xiàn)較難的問題。因此近年來,好氧反硝化研究逐漸發(fā)展起來,其反硝化過程可以在好氧狀態(tài)下,將硝酸鹽化合物還原成無害的氮氣,具有經(jīng)濟有效的生物除氮前景。但目前在實驗室條件下對好氧反硝化菌的調(diào)查和分離還不足,需要完善補充好氧反硝化微生物資源,為實現(xiàn)好氧硝化-反硝化高效除氮應用奠定重要基礎。本文以成都市鳳凰河二溝污水處理系統(tǒng)的水體為研究對象,比較了自然狀態(tài)和實驗室好氧條件下,好氧硝化和好氧反硝化細菌的功能多樣性;從中篩選了一株具有較強好氧硝酸鹽還原能力的代爾夫特菌(Delftia tsuruhatensis NF4),克隆硝酸鹽還原酶nap基因并進行原核表達和固定化脫氮功能研究,主要研究結果如下:(1)采用高通量Illumina Miseq測序技術對污水處理生態(tài)系統(tǒng)的總進水口,CRI出水口和總出水中的細菌多樣性進行研究,并比較了在好氧硝化和好氧反硝化培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物與自然水體中細菌多樣性的區(qū)別。結果共得到509,464條高質(zhì)量細菌16S rRNA序列,將序列進行分類得到九個細菌門,分別為厚壁菌門(Firmicutes),擬桿菌門(Bacteroidetes),變形菌門(Proteobacteria)等。其中變形菌門(Proteobacteria)是污水處理生態(tài)系統(tǒng)的優(yōu)勢類群。人工快滲系統(tǒng)(CRI)出水中變形菌門在自然條件下和在好氧硝化及好氧反硝化培養(yǎng)物中的豐度變化不大。而總進水和總出水樣品在好氧硝化和好氧反硝化的培養(yǎng)基中,變形菌門豐度顯著下降,擬桿菌門顯著增加�；谥髯鴺朔治�(PCoA)可知,對于相同采樣點水樣用好氧硝化和好氧反硝化培養(yǎng)基培養(yǎng),其兩兩聚合度均很高。說明利用好氧硝化和好氧反硝化培養(yǎng)基分離到的細菌在很大程度上是重疊的,這類細菌可能同時具有好氧硝化和反硝化功能。CRI的3個樣品的聚合度較進水口和出水口樣品的聚合度更高,說明人工快滲系統(tǒng)的水樣通過好氧硝化,好氧反硝化培養(yǎng)基培養(yǎng)后可以得到與自然水體更為接近的群落組成。(2)基于高通量測序結果,采用平板分離技術對CRI出水口的好氧硝酸鹽還原菌進行了分離純化和鑒定。得到一株好氧硝酸鹽還原能力較強的菌株NF4,對硝酸鹽去除率為96.8%。染色鏡檢為革蘭氏陰性桿菌,與食酸代爾夫特菌(Delftia]acidovorans)和Delftia tsuruhatensis的生化指標,包括發(fā)酵葡萄糖、木糖、乳糖、尿素,雙水解精氨酸,還原硝酸鹽進行比對發(fā)現(xiàn),與Delftia tsuruhatensis的相似度最高,且三株菌均具有硝酸鹽還原能力。16S rDNA分子生物學分析,初步鑒定為代爾夫特菌Delftia tsuruhatensis。該菌原來屬于叢毛單胞菌屬(Comamonas),隨著近年對于該菌的深入進化分支研究,將其單獨歸入代爾夫特菌屬。(3)通過海藻酸鈉包埋法,對游離Delftia tsuruhatensis NF4和固定化Delftia tsuruhatensis NF4的反硝化能力進行了比較測定。結果表明,兩者對硝酸鹽均有去除能力。在33 mg/L的硝態(tài)氮初始濃度、接種量5%(V/V)、溫度30℃、轉(zhuǎn)速140 r/min、初始pH 7.0的條件下,固定化菌株的硝態(tài)氮降解率、亞硝態(tài)氮積累量、總氮去除率分別為98.06%、27.46 mg/L、26.17%,為游離態(tài)菌株的1.5倍。因此,用海藻酸鈉固定化菌株Delftia tsuruhatensis NF4,能夠提高菌株反硝化性能。此外對固定化菌株Delftia tsuruhatensis NF4的固定化條件進行了優(yōu)化,其它條件不變,通過改變培養(yǎng)液中初始硝態(tài)氮濃度、初始pH值及培養(yǎng)溫度,研究固定化菌株Delftia tsuruhatensis NF4的硝酸鹽去除性能的影響,找到最優(yōu)硝酸鹽去除條件。結果表明,固定化Delftia tsuruhatensis NF4在pH值3-9、溫度20-45℃、硝態(tài)氮初始濃度16.5-165 mg/L均有硝酸鹽去除活性。在初始pH 7.0、溫度為30℃,硝態(tài)氮初始濃度為16.5 mg/L和33 mg/L時,去除率均為100%。硝態(tài)氮初始濃度16.5-165 mg/L之間時,24 h時硝酸鹽降解活性隨著初始濃度的增大而增強。(4)以Delftia tsuruhatensis NF4為出發(fā)菌,利用NCBI收錄的Delftia tsuruhatensis strain CM13菌的基因組硝酸鹽還原酶基因序列(登錄號:CP017420.1)為模板,設計nap基因的特異性引物,TA克隆構建重組克隆載體pMD 19-T-nap。利用Nde I/Xho I雙酶切和T4連接酶連接構建pET28a(+)-nap重組質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)獲得BL21(DE3)-pET28a(+)-nap E.colli工程菌并驗證。NCBI Blastp蛋白序列比對,表明代爾夫特菌Delftia tsuruhatensis NF4硝酸鹽還原酶氨基酸序列與Delftia tsuruhatensis的硝酸鹽還原酶(Sequence ID WP_047325778.1)同源性最高,為98.94%,與Delftia acidovorans的硝酸鹽還原酶(Sequence ID:WP_034399787.1,Sequence ID:WP_034399787.1)同源性也高于98%。該蛋白屬于Molybdopterin-Binding超家族成員。重組子表達的目的蛋白分子量約為101.375 kDa,與預測的蛋白大小相符合。20℃,0.2 mM IPTG條件下誘導的超聲破碎上清液表達量比0.4 mM IPTG誘導的略高。結合SDS-PAGE和Western Blot檢測結果可知,0.2 mM IPTG誘導主要以包涵體的形式表達,上清表達量低,0.4 mM IPTG誘導的以包涵體的形式表達。通過比較pET28a(+)-nap-BL21工程菌和pET28a(+)-BL21的硝酸鹽還原酶活,前者為40.28 U/L,后者為21.62 U/L。表明本實驗構建的pET28a(+)-nap-BL21工程菌能夠表達具有活性的硝酸鹽還原酶。
【學位授予單位】：成都理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;X703;X172
【圖文】：

圖 2-1 鳳凰河二溝污水處理生態(tài)系統(tǒng)水樣采集點Figure 2-1 Water Sample Collection Point of Sewage Treatment Ecosystem of FenghuangErgou River.2.2 樣品處理取 0.5 mL 鳳凰二河溝污水處理生態(tài)系統(tǒng)總進水口采集的水樣，分別涂布硝化培養(yǎng)基和好氧反硝化培養(yǎng)基，待菌落生長良好，用無菌水洗下菌苔，反洗三次，收集洗液。用一次性細菌濾器（濾膜孔徑 0.22 μm）過濾，-80 ℃暫存�？偝鏊诤腿斯た鞚B系統(tǒng)（CRI）出水口水樣處理方法與之相同，具表 2-1 所示。表 2-1 樣品編號和處理方式Table 2-1 Sample Number and Processing Method樣品編號 處理方式 來源IC 細菌濾器原水洗液 污水處理生態(tài)系統(tǒng)

圖 2-2 9 個樣品的 OTU 和 Tag 數(shù)量柱形圖Fig. 2-2 OTU and tag quantity cylindrical charts of the nine samples表 2-3 微生物多樣性及序列豐度信息Table 2-3 Microbial diversity and sequence abundance樣品編號 Clean reads OTU shannon simpson Chao 1 AceIC 46433 171 2.34 0.66 161.45 163.48EC 48924 88 2.16 0.68 85.21 89.71CRIC 54424 131 2.45 0.68 132.55 137.91I.DNF 80100 137 4.57 0.9 139.27 141.877E.DNF 56999 125 4.27 0.9 121 122.36CRI.DNF 64800 103 2.36 0.61 123.9 135.19I.NF 47463 142 4.46 0.88 161 158.931E.NF 50389 132 4.47 0.91 128.25 130.44CRI.NF 59932 118 3.42 0.84 117.81 125.99均值 56607 127.44 3.39 0.78 130.05 133.99

成都理工大學專業(yè)碩士學位論文工快滲系統(tǒng) CRI 出水口多樣性介于兩者之間。細菌多樣I.NF<CRIC，I.DNF<I.NF<IC，EC<E.DNF<E.NF。硝化培化培養(yǎng)基中的細菌有更高的多樣性，但出水口水樣的細菌培養(yǎng)基中的細菌多樣性低的原因有待進一步研究。曲線（RankAbundance）可以反映樣本中物種的豐富度和與物種的豐富度呈正相關，而曲線的平滑程度，反映了樣曲線越平緩，物種分布越均勻。從圖 2-3（b）中可知，水樣在水平方向上范圍最大，其物種多樣性最高。NF gr DNF group（反硝化培養(yǎng)基組）在垂直方向上，平滑程度培養(yǎng)后，細菌物種的分布更加均勻。

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本文編號：2761866