【摘要】：鎘(Cadmium,Cd)是環(huán)境中一種重金屬污染物,對機體有毒性作用。研究顯示骨骼作為Cd的主要靶器官之一,長期Cd暴露會導致多種骨骼疾病。軟骨細胞的增殖、分化、凋亡在其中發(fā)揮重要作用。禽類軟骨細胞異常會導致多種骨骼疾病,如肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良、佝僂病、骨性關節(jié)炎、關節(jié)退化等,且禽類的軟骨生長板有更為豐富的軟骨細胞和更深的血管侵入。因此,軟骨細胞的分化成熟在骨骼疾病中顯得十分重要,然而,目前Cd對雞軟骨發(fā)育、軟骨細胞增殖分化及凋亡的影響報道較少,所以本研究使用雞胚軟骨以及體外培養(yǎng)的原代雞軟骨細胞為對象,探究Cd對雞軟骨發(fā)育及軟骨細胞凋亡的影響。1 Cd對雞胚軟骨發(fā)育的影響為探究Cd對雞胚軟骨發(fā)育的影響,對8日齡雞胚卵黃囊接種不同濃度Cd(0、0.05、0.1、0.2 mg/mL),處理8 d。石蠟切片和阿爾新藍-茜素紅染色觀察軟骨生長板發(fā)育情況;掃描電鏡觀察關節(jié)軟骨表明結構;qRT-PCR檢測軟骨相關因子Acan、Col2al、Sox9、Coll0al、Mmp-13、Rankl、Opg的表達。結果顯示Cd能使生長板軟骨細胞分泌的ACAN減少、細胞核固縮溶解;Cd處理組軟骨表面膠原纖維變得疏松,排序紊亂。低劑量組(0.05 mg/mL Cd)與對照組相比軟骨分化前期相關因子Acan、Sox9、C012al顯著升高(P0.05),但軟骨分化后期相關轉錄因子Mmp-13、Col10al表達水平顯著(P0.05)或極顯著(P0.01)降低,高濃度組均呈抑制作用且呈劑量依賴性。表明低濃度Cd能促進軟骨早期分化,但高濃度Cd對軟骨生長發(fā)育有抑制作用。2 Cd對雞軟骨細胞增殖肥大的影響為探究Cd對雞軟骨細胞增殖肥大的影響,使用不同濃度Cd(0、0.2、2、5、10、20μμM)處理體外培養(yǎng)的原代雞軟骨細胞2、4、6 d,CCK-8檢測軟骨細胞增殖水平,阿爾新藍染色鑒定軟骨細胞,qRT-PCR檢測軟骨細胞相關因子Acan Col2al、Coll0a1、Sox9、mp-13、Rankl、Opg的表達。結果顯示,0.2 μM Cd處理2 d后軟骨細胞分化前期標志性mRNAAcan、Col2a1、Sox9與對照組相比表達量極顯著升高(P0.01),隨著Cd濃度升高,表達量呈劑量依賴性下降;Cd處理6 d后軟骨細胞分化后期標志性mRNA Col10al、Mmp-13與對照組相比表達量均呈顯著(P0.05)或極顯著(P0.01)下降;2、5、10μMCd處理6d后Rankl、Opg與對照組相比表達量極顯著升高(P0.01)。以上結果表明低濃度的Cd可以在早期促進軟骨細胞增殖,但隨著時間的推移Cd抑制了軟骨細胞的分化和成熟,并可影響RANKL/OPG通路。3 Cd對雞軟骨細胞凋亡的影響為了探究Cd對軟骨細胞凋亡的影響,本研究采用不同濃度Cd(0、0.2、2、5、10、20 μM)處理體外培養(yǎng)雞軟骨細胞12 h,CCK-8檢測軟骨細胞活性;AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測軟骨細胞凋亡;JC-1檢測軟骨細胞線粒體膜電位變化;DAPI染色觀察細胞核形態(tài)學變化;掃描電鏡觀察軟骨細胞表面結構;Westem Blot檢測Cleavedcaspase-3表達。結果顯示,與對照組相比5μM以上Cd能顯著(P0.05)降低軟骨細胞活性,促進軟骨細胞凋亡,促使細胞表面結構損傷。2 μM以上Cd能顯著降(P0.05)低軟骨細胞線粒體膜電位水平并且此時細胞核出現(xiàn)皺縮,Cleavedcaspase-3表達水平顯著升高(P0.05)。表明Cd能誘導雞軟骨細胞凋亡。
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.31;X503.22
【圖文】：

生長板內(nèi)的軟骨細胞可以區(qū)分為四種不同的細胞層：靜止區(qū)軟骨細胞層、增殖區(qū)軟骨逡逑細胞層、肥大區(qū)軟骨細胞層、干骺端細胞鈣化沉積層，根據(jù)軟骨細胞形態(tài)的不同，增殖區(qū)逡逑軟骨細胞又可以分為圓形和柱形軟骨細胞（圖１－１）。軟骨細胞可表達表皮生長因子受體逡逑（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｅｇ斤），但不同階段的軟骨細胞表達不同的基因，在軟骨逡逑細胞增殖期，圓形和柱形軟骨細胞主要表達甲狀旁腺激素相關肽（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ邋Ｈｏｒｍｏｎｅ－逡逑ｒｅｌａｔｅｄＰｅｐｔｉｄｅ，ＰＴＨｒＰ）、轉錄因子邋Ｓ０Ｘ５邋（＆？５）、Ｓ０Ｘ６邋（？ＳｏＭ）、Ｓ０Ｘ９邋（ＳｏｘＰ）、聚蛋白逡逑多糖（Ａｇｇｒｅｃａｎ，Ａｃａｎ）、ＩＩ邋型膠原酶（ｃｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅｌｌａｌｐｈａｌｃｈａｉｎ，Ｃｏｌ２ａｌ）等，肥大軟骨逡逑細胞分泌Ａｃａｎ、Ｃｏｌ２ａｌ、Ｃ型利尿納肽（Ｃ－ｔｙｐｅ邋ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ邋ｐｅｐｔｉｄｅ，ＣＮＰ」、轉化生長因子逡逑ａ邋（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｆａｃｔｏｒ－ａ，ｒｇｆ－ｏｔ）、ＩＨＨ邋配體（Ｉｎｄｉａｎ邋Ｈｅｄｇｅｈｏｇ，ｆＭ）、甲狀旁腺激逡逑素受體（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ邋Ｈｏｒｍｏｎｅ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＰＴＨｌｒ）、轉錄因子邋Ｒｕｎｘ２邐成纖維細胞生逡逑長因子受體（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｆａｃｔｏｒ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ

＼逡逑（ｗｌ．）邋０邐０．０５邐０，１邐０．２邋ｃ＜Ｈｍｖ0ｉＬ＞邋ｔ邋ａ邋ｔ．ｉ圖１－３不同濃度Ｃｄ對雞胚骨骼發(fā)育的影響逡逑Ｆｉｇ邋１－３邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋Ｃｄ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｓｋｅｌｅｔａｌ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ邋ｉｎ邋ｃｈｉｃｋｅｎ邋ｅｍｂｒｙ３．４邋Ｃｄ對關節(jié)軟骨表面超微結構的影響逡逑掃描電鏡觀察關節(jié)軟骨表面超微結構，由圖１－４可見對照組關節(jié)膠原纖維排列較為致密，０．０５邋ｍｇ／ｍＬＣｄ和０．１邋ｍｇ／ｍＬＣｄ組膠原纖維逐漸變得松散，且排列錯ｍｇ／ｍＬ邋Ｃｄ組膠原纖維變得極為松散。邐逡逑

３．５邋Ｃｄ對雞胚關節(jié)軟骨標志性ｍＲＮＡ表達的影響逡逑雞胚卵黃囊接種Ｃｄ邋—周后，利用熒光定量ＰＣＲ檢測雞關節(jié)軟骨標志性ｍＲＮＡ的表逡逑達變化。結果如圖１－５，也伽、的表達量在低濃度Ｃｄ組（０．０５ｍｇ／ｍＬ）有上逡逑升趨勢，但Ｊａｗ與ＳｏｘＰ的上升趨勢不顯著（＿Ｐ＞０．０５），而基因表達顯著上升（戶＜０．０５）。逡逑隨著Ｃｄ濃度的增加，Ｊａｗ、Ｃｏ／２ａ八表達量隨之下降，在０．１邋ｍｇ／ｍＬＣｄ組和逡逑０．２邋ｍｇ／ｍＬＣｄ組均呈極顯著下降趨勢（Ｐ＜０．０１），ｚｉｃａ／ｊ、Ｃｏ／２ａ／在０．２邋ｍｇ／ｍＬＣｄ組極顯著逡逑下降（Ｐ＜０．０１）。Ｃｏ／７伽ｉ和表達量隨著Ｃｄ濃度的增加呈劑量依賴的下降趨勢逡逑（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５）邋Ｘｄ組表達下降，０？邋ｌｍｇ／ｍＬＣｄ組與對照組相比差異顯著（Ｚ＾Ｏ．ＯＳ），逡逑而的表達量隨Ｃｄ濃度上升而上升，呈劑量依賴性，但差異不顯著（Ｐ＜０．０５）。逡逑ＡＣ邋ＡＮ邐Ｃ０Ｌ２Ａ１逡逑＿邋２Ｊｈ邐Ｓ０Ｘ９逡逑＿邋１ＪＨ邐１－邋ｊ0邐－ｓ邋１－＊－逡逑Ｉｓ５＊－邋Ｓ邋＾邐ｉｌ１－５－邋Ｂ邋－ｊ－邐Ｐ１°＿邋W逡逑ｉｌｉ邋ｉ－ＭＭＭｍ邋ｒｌｌｉ＾逡逑＾邋Ｈ邋ｌｌ！ｉ｜ｉｌｉ：ｌ邋占。ＪＭ邐Ｍ．陶ｉ邋ｉ°ｃＪｉｐ邋Ｍ邋Ｍ邋ｌｌｌｌｉｉｌ逡逑Ｃｄ（ｍｇ／ｎ，ｌ）邋０邐０．０５邐０．１邐０．２邋ｃｄ（ｍ９／ｍＬ）邋０邐０．０５邐０．１邐Ｃｄ（ｍｇ／ｍｌ）邋０邐０．０５邋Ｏ．ｔ邋０．２逡逑ＭＭＰ－１３邐ＣＯＬ１０Ａ１逡逑１．５－ｊ邐１，Ｓ＊逡逑１邋Ｘ逡逑？邋Ｉｆ邋１．０－邋Ｍ逡逑自ｌ卜■—鑫２逡逑占＇邋Ｊ罪攀

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本文編號：2761720