【摘要】：有機磷農(nóng)藥具有一定的胚胎毒性,能夠影響胚胎的發(fā)育。實驗室之前的研究發(fā)現(xiàn)久效磷暴露斑馬魚胚胎能夠影響其生殖腺的發(fā)育,導致卵巢內(nèi)生殖細胞形態(tài)和排列的異常。為進一步探究久效磷對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性效應,本文統(tǒng)計分析了久效磷對斑馬魚胚胎存活率、孵化率、心跳、畸形情況(心包囊腫和骨骼彎曲)、運動行為(自發(fā)運動)以及生長水平(頭長和體長)的影響,首先從個體水平上探討了久效磷的胚胎毒性。多種基因參與調控了斑馬魚胚胎的發(fā)育,久效磷暴露斑馬魚導致的心包囊腫、脊柱彎曲和性腺結構異�？赡苁且驗槠溆绊懥税l(fā)育相關基因的表達,而外源物質能夠通過改變基因啟動子區(qū)的甲基化水平來影響基因的表達。因此,本文進一步研究了久效磷暴露斑馬魚胚胎對心臟發(fā)育基因(Tbx2)、肌肉發(fā)育基因(Mef2c)和性腺發(fā)育基因(Vasa) mRNA表達水平的影響,以及久效磷暴露斑馬魚對Vasa基因啟動子區(qū)甲基化水平的影響,從分子水平探討了久效磷對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的潛在機制。本文研究結果表明：(1)0.0004、0.004、0.04和0.4mg/L的久效磷暴露斑馬魚胚胎至96hpf (hour post fertilization),對胚胎的存活率、死亡率、頭長、體長以及自發(fā)運動均無顯著影響。久效磷暴露顯著降低了36hpf斑馬魚胚胎的心跳,升高了96hpf仔魚心包囊腫和脊柱彎曲的百分比,說明久效磷具有胚胎毒性,主要表現(xiàn)為致畸性,能夠影響斑馬魚心臟和骨骼的發(fā)育。(2)0.0004、0.004、0.04和0.4mg/L的久效磷暴露斑馬魚胚胎至96hpf,采用實時定量PCR(real-time PCR)檢測48和60hpf心臟發(fā)育相關基因T盒子2(Tbx2)、肌細胞增強因子2C(Mef2c),以及48、60和96hpf性腺發(fā)育相關基因Vasa(DEAD-family protein of ATP-dependent RNA helicase) mRNA的表達水平。研究結果表明,久效磷暴露降低了48hpf胚胎Tbx2基因的表達水平,而對60hpf胚胎Tbx2基因表達水平無影響；暴露升高了48hpf胚胎Mef2c基因的表達水平,但是,對60hpf胚胎Mef2c基因表達水平無影響,說明久效磷可能是通過影響Tbx2和Mef2c基因在心臟發(fā)育關鍵期內(nèi)(48hpf內(nèi))的表達水平,進而影響心臟的正常發(fā)育。另外,久效磷暴露對96hpf胚胎Vasa基因表達水平無影響,但降低了48和60hpf胚胎Vasa基因的表達水平,可能會對PGCs的遷移過程產(chǎn)生影響。(3)0.0004、0.004、0.04和0.4mg/L的久效磷暴露斑馬魚胚胎至96hpf,采用亞硫酸氫鹽測序(BSP)方法檢測Vasa基因啟動子區(qū)5個CpG位點的甲基化狀態(tài),采用實時定量PCR檢測48、60和96hpf DNA甲基轉移酶基因(Dnmt1)以及基化CpG連接蛋白2基因(Mecp2) mRNA的表達水平。結果表明：久效磷暴露斑馬魚胚胎至48、60和96hpf, Vasa基因啟動子區(qū)的甲基化水平均無顯著差異,說明久效磷可能不是通過影響Vasa基因啟動子區(qū)的甲基化水平來影響其基因表達的。另外,久效磷暴露對Dnmt1基因的表達無影響,卻升高了Mecp2基因的表達水平,說明組蛋白的去乙�；图谆赡苁蔷眯Я子绊慥asa基因表達的潛在機制。綜上,本研究表明,久效磷具有胚胎毒性,在個體水平上,能夠影響心臟和骨骼的發(fā)育,導致心包囊腫和骨骼彎曲;在分子水平上,久效磷能夠通過影響心臟發(fā)育相關基因Tbx2、肌肉發(fā)育基因Mef2c以及性腺發(fā)育相關基因Vasa的表達水平,進而影響心臟和性腺發(fā)育；并且進一步研究發(fā)現(xiàn),DNA甲基化并不是久效磷影響Vasa基因表達的潛在機制,久效磷可能是通過影響組蛋白的乙�；图谆絹碛绊慥asa基因的表達。因此,本文從個體水平和分子水平(包括mRNA水平和DNA水平),探討了久效磷對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性效應及其潛在機制,以期為外源化合物的胚胎毒性研究提供更多的研究思路。
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：X592

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本文編號：2754658