【摘要】：有機(jī)磷農(nóng)藥具有一定的胚胎毒性,能夠影響胚胎的發(fā)育。實(shí)驗(yàn)室之前的研究發(fā)現(xiàn)久效磷暴露斑馬魚(yú)胚胎能夠影響其生殖腺的發(fā)育,導(dǎo)致卵巢內(nèi)生殖細(xì)胞形態(tài)和排列的異常。為進(jìn)一步探究久效磷對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng),本文統(tǒng)計(jì)分析了久效磷對(duì)斑馬魚(yú)胚胎存活率、孵化率、心跳、畸形情況(心包囊腫和骨骼彎曲)、運(yùn)動(dòng)行為(自發(fā)運(yùn)動(dòng))以及生長(zhǎng)水平(頭長(zhǎng)和體長(zhǎng))的影響,首先從個(gè)體水平上探討了久效磷的胚胎毒性。多種基因參與調(diào)控了斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育,久效磷暴露斑馬魚(yú)導(dǎo)致的心包囊腫、脊柱彎曲和性腺結(jié)構(gòu)異常可能是因?yàn)槠溆绊懥税l(fā)育相關(guān)基因的表達(dá),而外源物質(zhì)能夠通過(guò)改變基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平來(lái)影響基因的表達(dá)。因此,本文進(jìn)一步研究了久效磷暴露斑馬魚(yú)胚胎對(duì)心臟發(fā)育基因(Tbx2)、肌肉發(fā)育基因(Mef2c)和性腺發(fā)育基因(Vasa) mRNA表達(dá)水平的影響,以及久效磷暴露斑馬魚(yú)對(duì)Vasa基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的影響,從分子水平探討了久效磷對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育毒性的潛在機(jī)制。本文研究結(jié)果表明：(1)0.0004、0.004、0.04和0.4mg/L的久效磷暴露斑馬魚(yú)胚胎至96hpf (hour post fertilization),對(duì)胚胎的存活率、死亡率、頭長(zhǎng)、體長(zhǎng)以及自發(fā)運(yùn)動(dòng)均無(wú)顯著影響。久效磷暴露顯著降低了36hpf斑馬魚(yú)胚胎的心跳,升高了96hpf仔魚(yú)心包囊腫和脊柱彎曲的百分比,說(shuō)明久效磷具有胚胎毒性,主要表現(xiàn)為致畸性,能夠影響斑馬魚(yú)心臟和骨骼的發(fā)育。(2)0.0004、0.004、0.04和0.4mg/L的久效磷暴露斑馬魚(yú)胚胎至96hpf,采用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)48和60hpf心臟發(fā)育相關(guān)基因T盒子2(Tbx2)、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C(Mef2c),以及48、60和96hpf性腺發(fā)育相關(guān)基因Vasa(DEAD-family protein of ATP-dependent RNA helicase) mRNA的表達(dá)水平。研究結(jié)果表明,久效磷暴露降低了48hpf胚胎Tbx2基因的表達(dá)水平,而對(duì)60hpf胚胎Tbx2基因表達(dá)水平無(wú)影響；暴露升高了48hpf胚胎Mef2c基因的表達(dá)水平,但是,對(duì)60hpf胚胎Mef2c基因表達(dá)水平無(wú)影響,說(shuō)明久效磷可能是通過(guò)影響Tbx2和Mef2c基因在心臟發(fā)育關(guān)鍵期內(nèi)(48hpf內(nèi))的表達(dá)水平,進(jìn)而影響心臟的正常發(fā)育。另外,久效磷暴露對(duì)96hpf胚胎Vasa基因表達(dá)水平無(wú)影響,但降低了48和60hpf胚胎Vasa基因的表達(dá)水平,可能會(huì)對(duì)PGCs的遷移過(guò)程產(chǎn)生影響。(3)0.0004、0.004、0.04和0.4mg/L的久效磷暴露斑馬魚(yú)胚胎至96hpf,采用亞硫酸氫鹽測(cè)序(BSP)方法檢測(cè)Vasa基因啟動(dòng)子區(qū)5個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài),采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)48、60和96hpf DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因(Dnmt1)以及基化CpG連接蛋白2基因(Mecp2) mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明：久效磷暴露斑馬魚(yú)胚胎至48、60和96hpf, Vasa基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平均無(wú)顯著差異,說(shuō)明久效磷可能不是通過(guò)影響Vasa基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平來(lái)影響其基因表達(dá)的。另外,久效磷暴露對(duì)Dnmt1基因的表達(dá)無(wú)影響,卻升高了Mecp2基因的表達(dá)水平,說(shuō)明組蛋白的去乙�；图谆赡苁蔷眯Я子绊慥asa基因表達(dá)的潛在機(jī)制。綜上,本研究表明,久效磷具有胚胎毒性,在個(gè)體水平上,能夠影響心臟和骨骼的發(fā)育,導(dǎo)致心包囊腫和骨骼彎曲;在分子水平上,久效磷能夠通過(guò)影響心臟發(fā)育相關(guān)基因Tbx2、肌肉發(fā)育基因Mef2c以及性腺發(fā)育相關(guān)基因Vasa的表達(dá)水平,進(jìn)而影響心臟和性腺發(fā)育；并且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),DNA甲基化并不是久效磷影響Vasa基因表達(dá)的潛在機(jī)制,久效磷可能是通過(guò)影響組蛋白的乙酰化和甲基化水平來(lái)影響Vasa基因的表達(dá)。因此,本文從個(gè)體水平和分子水平(包括mRNA水平和DNA水平),探討了久效磷對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)及其潛在機(jī)制,以期為外源化合物的胚胎毒性研究提供更多的研究思路。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：X592

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本文編號(hào)：2754658