【摘要】：目的描述某冶煉廠周圍農(nóng)田土壤中抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)和可移動(dòng)遺傳元件(Mobile Genetic Elements,MGEs)的分布,并研究該農(nóng)田土壤中抗生素、重金屬、細(xì)菌群落等因素對(duì)ARGs分布的影響。方法1.采用高通量熒光定量PCR(High-throughput quantitative PCR,HT-QPCR)對(duì)8類共310種抗生素抗性基因(Antibiotics Resistance Genes,ARGs)和9種可移動(dòng)遺傳元件(Mobile Genetic Elements,MGEs)進(jìn)行相對(duì)定量分析。以16S rDNA基因?yàn)閮?nèi)參,用ΔC_T方法計(jì)算相對(duì)豐度。2.采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)該地農(nóng)田土壤中5種抗生素(磺胺嘧啶、諾氟沙星、羅紅霉素、四環(huán)素和氯霉素)的濃度;同時(shí)對(duì)土壤中8種重金屬含量和5種理化性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。3.運(yùn)用DGGE方法和Illunima Miseq方法分別分析土壤可培養(yǎng)細(xì)菌群落和總細(xì)菌群落。4.Excel 2010整理數(shù)據(jù),SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)的正態(tài)性。用SPSS 21.0進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)以及聚類分析(clustering analysis),用Canoco5.0軟件和R軟件進(jìn)行冗余分析(redundancy analysis,RDA)�；赟pearman秩相關(guān)R~20.65和P0.05,采用Gephi進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。運(yùn)用Pearson相關(guān)和Spearman秩相關(guān)分析抗生素、重金屬、理化性質(zhì)含量和可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)與ARGs及MGEs相對(duì)豐度之間的相關(guān)性。結(jié)果1.ARGs和MGEs分布的檢測(cè)7個(gè)土樣總共檢出149種ARGs,檢出陽性率最高的是FCA類抗性基因,為77.8%,其次是氨基糖苷類抗性基因和磺胺類抗性基因,陽性率分別為61.1%,60.0%。距離工廠最遠(yuǎn)的G7土樣檢出的ARGs種類最多,為90種。7個(gè)土樣中ARGs的相對(duì)豐度總和范圍在1.09×10~(-2)~3.63×10~(-1)。在距離工廠最近的G1土樣中,ARGs相對(duì)豐度總和為3.63×10~(-1),遠(yuǎn)高于其它土樣。7個(gè)土樣以磺胺類抗性基因的相對(duì)豐度總和最高,為3.44×10~(-1)。網(wǎng)絡(luò)分析顯示有13種萬古霉素類抗性基因、14種四環(huán)素類抗性基因、3種磺胺類抗性基因、23種β-內(nèi)酰胺類抗性基因、22種氨基糖苷類抗性基因、22種MLSB類抗性基因、21種FCA類抗性基因、30種其它/外排泵類抗性基因和5種MGEs的相對(duì)豐度之間存在關(guān)聯(lián)(P0.05)。2.抗生素和重金屬含量測(cè)定磺胺嘧啶、諾氟沙星、羅紅霉素、四環(huán)素在7個(gè)土樣中均被檢出,氯霉素未檢出。四環(huán)素含量在G7土樣最高,為1738.534μg/kg,高于其它抗生素含量。除了Ni和Cr無污染外,6種重金屬(鎘(Cd)、鉛(Pb)、砷(As)、汞(Hg)、銅(Cu)、鋅(Zn))均存在超標(biāo)現(xiàn)象。G1土樣重金屬污染最嚴(yán)重。3.細(xì)菌群落結(jié)果檢測(cè)7個(gè)土樣的可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)范圍在1.67×10~5~8.33×10~5個(gè)/g之間。DGGE分析可培養(yǎng)細(xì)菌群落,發(fā)現(xiàn)11個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬,屬于變形菌門和厚壁菌門。主成分分析和聚類分析表明,G1和G2可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似,與其它土樣有差異。RDA顯示,四環(huán)素含量和Cu含量能夠影響可培養(yǎng)細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)(P0.05)。Illumina分析土壤總細(xì)菌群落,發(fā)現(xiàn)變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門的豐度較高。裝甲菌門、迷蹤菌門、綠菌門和擬桿菌門的豐度在7個(gè)土樣中存在差異(P值均小于0.05)。熱圖顯示,G1和G2土壤總細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌屬相似,與其它土樣差異較大。RDA分析顯示,四環(huán)素濃度和Cd、Pb、As、Hg、Cu、Zn含量對(duì)土壤總細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有影響(P值均小于0.05)。4.抗生素、重金屬、理化性質(zhì)含量對(duì)ARGs和MGEs分布的影響Pearson相關(guān)和Spearman秩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),4種抗生素(磺胺嘧啶、諾氟沙星、羅紅霉素、四環(huán)素)含量共與26種基因(25種ARGs、1種MGE)的相對(duì)豐度相關(guān)。8種重金屬含量共與33種基因(30種ARGs、3種MGEs)的相對(duì)豐度相關(guān)。5種理化性質(zhì)(總磷、總氮、有機(jī)質(zhì)、pH、含水率)共與36種基因(34種ARGs、2種MGEs)的相對(duì)豐度相關(guān)。5.細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)ARGs和MGEs分布的影響可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)與7種ARGs(mphA-01、adeA、mexE、mexF、oprJ、vatE-01、yceL/mdtH-01)的相對(duì)豐度相關(guān)。總細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)39種細(xì)菌菌門豐度與71種基因(67種ARGs、4種MGEs)相對(duì)豐度相關(guān)(P值均小于0.05)。6.抗生素、重金屬含量及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)ARGs和MGEs分布影響的比較共有87種ARGs的相對(duì)豐度與土壤抗生素含量、重金屬含量、理化性質(zhì)、可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)或細(xì)菌菌門豐度相關(guān)。5種因素各自單一作用下影響了36種ARGs的相對(duì)豐度,受兩種及兩種以上因素作用影響的ARGs種類數(shù)有51個(gè)。其中,單一受“細(xì)菌菌門豐度”因素影響的ARGs種類數(shù)最多,達(dá)25種(25/87,28.74%)。細(xì)菌菌門豐度與其他影響因素共同作用,又影響了另外42種ARGs的相對(duì)豐度,合計(jì)細(xì)菌菌門豐度共影響了67種ARGs的相對(duì)豐度,占ARGs總種類數(shù)的77.01%。單一受抗生素含量、重金屬含量和理化性質(zhì)等因素影響的ARGs種類數(shù)比較少,分別是4、1、3種,遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于它們各自與其他因素聯(lián)合作用時(shí)影響的ARGs種類數(shù)(分別是21、29、31種)。結(jié)論1.該農(nóng)田土壤中檢出ARGs的陽性率以FCA類抗性基因最高,其次是氨基糖苷類抗性基因和磺胺類抗性基因,相對(duì)豐度總和最高的是磺胺類抗性基因。各ARGs相對(duì)豐度與土壤總細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、抗生素含量、重金屬含量、理化性質(zhì)和可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)等因素有關(guān),受土壤總細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響的ARGs種類數(shù)最多。2.土壤抗生素、重金屬、理化性質(zhì)和可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)等因素可獨(dú)自影響某些ARGs的分布,但更多可能是通過影響土壤總細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)對(duì)ARGs分布的影響。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：X53
【圖文】：

結(jié)果表 3.1 各土樣中不同 ARGs 類型的檢測(cè)陽性數(shù)（率%）n G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7omyn35 4(11.4) 4(11.4) 6(17.1) 7(20.0) 0(0.0) 4(11.3) 7(20.0acyne44 3(6.8) 4(9.09) 8(18.18) 8(18.18) 6(13.64) 6(13.64) 8(18.2onade5 2(40.0) 1(20.00) 1(20.00) 1(20.00) 1(20.00) 1(20.00) 1(20.0tatase54 10(18.9) 11(20.4) 13(24.1) 16(29.6) 5（9.3） 11(20.4) 15(27.oglyide36 7(19.4) 5(13.9) 14(38.9) 10(27.8) 6(16.7) 9(25.0) 14(38.SB 53 9(17.0) 7(13.2) 7(13.2) 13(24.5) 4(7.6) 4(7.6) 13(24.A 27 9(33.3) 12(44.4) 13(48.2) 13(48.2) 10(37.0) 10(37.0) 15(55.erlux56 16(28.6) 11(19.6) 13(23.2) 18(32.1) 7(12.5) 8(14.30) 17(30. 310 60(19.3) 55(17.7) 75(24.2) 86(27.7) 39(12.6) 53(17.1) 90(29.

圖 3.2 各土樣 ARGs 相對(duì)豐度和 MGEs 相對(duì)豐度分布（n=7）mycin：萬古霉素類抗性基因；Tetracycline：四環(huán)素類抗性基因；Sulfonamide：；Beta Lactamase：β-內(nèi)酰胺類抗性基因；Aminoglycoside：氨基糖苷類抗性基環(huán)內(nèi)酯類-林可霉素類-鏈陽性菌素 B 抗性基因；FCA：喹諾酮類-氯霉素類抗性基 其它/外排泵類抗性基因；MGEs：可移動(dòng)遺傳元件。

圖 3.2 各土樣 ARGs 相對(duì)豐度和 MGEs 相對(duì)豐度分布（n=7）萬古霉素類抗性基因；Tetracycline：四環(huán)素類抗性基因；Sulfoa Lactamase：β-內(nèi)酰胺類抗性基因；Aminoglycoside：氨基糖苷類-林可霉素類-鏈陽性菌素 B 抗性基因；FCA：喹諾酮類-氯霉素排泵類抗性基因；MGEs：可移動(dòng)遺傳元件。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2752329