【摘要】：【目的】克隆芽孢桿菌HJ14的酯酶基因Est Z1并利用大腸桿菌表達得到相應(yīng)的酯酶,分析重組酯酶的酶學性質(zhì)和對鄰苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate,DEP)的降解�！痉椒ā刻禺愋詳U增酯酶基因Est Z1并對其全長測序,分析其氨基酸序列。利用p EASY-E2表達系統(tǒng)將Est Z1轉(zhuǎn)化到Escherichia coli BL21(DE3)中完成異源表達。根據(jù)組氨酸標簽純化Est Z1,研究其酶學性質(zhì)并利用HPLC和LC/MS檢測系統(tǒng)定性分析其對DEP的降解�！窘Y(jié)果】Est Z1全長903 bp,編碼300個氨基酸殘基,蛋白分子量33.84 k Da。Est Z1氨基酸序列分析結(jié)果顯示,與NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的HSL-like家族酯酶相似度最高可達到98%。酶學性質(zhì)分析結(jié)果顯示,Est Z1可水解碳鏈長度較短的p-NP底物,最適底物為p-NPC4(p-NP butyrate)。Est Z1的最適p H和最適溫度分別為9.0和50°C,并且在p H 7.0 9.5和40 70°C范圍內(nèi)保持50%以上的酶活,為耐熱堿性酯酶。Est Z1對多數(shù)金屬離子和化學試劑保有良好的抗性。Est Z1可將DEP水解生成相應(yīng)的單酯和醇�！窘Y(jié)論】本文報道了Bacillus sp.HJ14來源的酯酶基因并對其在大腸桿菌中表達獲得的重組酶的酶學性質(zhì)進行研究,Est Z1具有良好的堿性p H耐受性和熱穩(wěn)定性,能夠部分降解DEP,本研究對鄰苯二甲酸酯類的生物降解有一定的參考意義。
【圖文】：

EstZ1的多序列比對分析Figure2.MultiplesequencealignmentofEstZ1.SequencesretrievedfromtheNCBIserverwerealignedinCLUSTALWandrenderedusingESPriptoutput.Sequencesaregroupedaccordingtosimilarity.EstZ1fromBacillussp.HJ14;3AIKfromFerroplasma;KPN14852fromBacillussp.NH7I_1;AAG09918fromBacilluspumilus;KOO40129fromBacillusokuhidensis;KOS02876fromPaenibacilluspolymyxa;five-pointedstarindicateaminoacidresiduesbelongingtothecatalyt

X-100對EstZ1的活性有部分促進(大約11.1% 46.5%)；Na+，Pb2+，Mn2+，Ni2+，Cu2+，methylalcohol，acetone對EstZ1的活性影響較小(保持在88.0% 105.5%)；Co2+，Hg2+，SDS，β-mercaptoethanol，Tween-80，Ethylalcohol對EstZ1的活性有部分抑制(大約15.3% 78.8%)。其中可破壞二硫鍵的β-mercaptoethanol對EstZ1有強烈抑制，說明二硫鍵對于EstZ1的穩(wěn)定性和活性有較大影響。2.5EstZ1對鄰苯二甲酸二乙酯的降解HPLC分析結(jié)果顯示鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)標品的保留時間為5.080(圖5-A)，產(chǎn)物中除圖3.純化酶EstZ1的SDS-PAGE分析Figure3.PurificationofEstZ1.Lane1:totalproteinsofE.coliBL21(DE3)withblankvectorpEASY-E2;Lane2:totalproteinsofE.coliBL21(DE3)harboringtherecombinantplasmidpEASY-E2-EstZ1;Lane3:purifiedEstZ1;LaneM:proteinmolecularweightmarker.圖4.純化酶EstZ1的酶學特性Figure4.TheenzymaticcharacteristicsofpurifiedEstZ1.A:EffectofpHonEstZ1activity.Reactionswereperformedindifferentbufferswiththeconcentrationof50mmol/Lrangefrom5.0 11.0(McIlvainebufferforpH5.0 8.0,Tris-HClbufferforpH7.0 9.0andBoratebufferforpH9.0 11.0)at37°C,respectively.B:pHstabilityofEstZ1.Theenzymewasincubatedfor1hinbuffersofvariouspHvalues(pH2.0 12.0)at37°C.C:EffectoftemperatureonEstZ1activitywasdeterminedusingp-NPC4assubstrateinthetemperaturerangeof0°Cto95°CinTris-HClbuffer(50mmol/L,pH9.0).D:ThermostabilityofEstZ1.Theenzymewasincubatedfor1hat37°C,60°Cand80°C.1938ZhengPengetal.|ActaMicrobiologicaSinica,2016,56(12)actamicro@im.ac

了在相同的保留時間出現(xiàn)峰還出現(xiàn)了新的峰，表明產(chǎn)物中除了DEP(分子量222)還有新物質(zhì)生成(圖5-B)。酯酶水解鄰苯二甲酸酯類的降解途徑為酯鍵逐個水解或者同時水解(圖6)，所以DEP的可能降解產(chǎn)物有鄰苯二甲酸單乙酯(MEP，分子量194)和鄰苯二甲酸(PTH，分子量166)。LC/MS的分析結(jié)果顯示，可以得到加Na+的分子離子峰m/z為245(圖7-A)，減H+的分子離子峰m/z為193(圖7-B)，根據(jù)分子量推算可以推測出EstZ1水解DEP可生成MEP。表3.金屬離子和化學試劑對EstZ1的活力影響Table3.EffectofvariousmetalionsandchemicalagentsonenzymeactivityReagentsConcentrateRelativeactivity/%None0mmol/L100.0±0.4Ag+1mmol/L113.2±0.7Ca2+1mmol/L93.1±0.1K+1mmol/L85.8±0.4Fe2+1mmol/L111.2±0.3Zn2+1mmol/L34.0±0.2Mg2+1mmol/L91.5±0.4Na+1mmol/L103.0±0.2Mn2+1mmol/L93.7±0.3Fe3+1mmol/L146.5±0.0Pb2+1mmol/L88.0±0.1Ni2+1mmol/L103.1±0.9Co2+1mmol/L84.7±0.1Cu2+1mmol/L105.5±0.4Hg2+1mmol/L39.7±0.1Al3+1mmol/L128.3±0.3EDTA1mmol/L125.8±0.2SDS1mmol/L60.4±1.0β-mercaptoethanol1mmol/L21.2±0.1TritonX-1001%V/V111.1±0.1Tween-801%V/V67.1±0.7Methylalcohol1%V/V91.4±0.5Alcohol1%V/V75.1±0.4Acetone1%V/V95.4±0.5圖5.HPLC分析結(jié)果Figure5.TheresultsofHPLCanalyses.A:DEPstandardsample.B:TheresultsofDEPdegradationafterincubationwithEstZ1.圖6.酯酶對鄰苯二甲酸酯水解Figure6.DegradationofPAEsbyesterase.彭政等|微生物學報,2016,56(12)1939http://journals.im.ac.cn/actamicrocn

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周祖蔭;戚正武;;豬胰激肽釋放酶的酶學性質(zhì)[J];生化藥物雜志;1984年04期

2 陳衛(wèi),張灝,丁霄霖;一種高溫乳糖酶的酶學性質(zhì)及對牛乳中乳糖的水解[J];中國乳品工業(yè);2002年06期

3 王在貴;劉朝良;楊文靜;朱保建;魏國清;方楊武;張鵬飛;陳睿;;家蠶腸道枯草桿菌產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵條件與酶學性質(zhì)[J];激光生物學報;2010年03期

4 劉小林;;多聚半乳糖醛酸酶及其化學修飾酶的酶學性質(zhì)[J];江蘇農(nóng)業(yè)學報;2011年02期

5 陳明霞;李和陽;陳維維;刁偉程;劉承忠;袁敏;李曉虹;;68株北極產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選、鑒定以及部分酶學性質(zhì)[J];微生物學報;2013年07期

6 唐良華;夏黎明;蘇敏;;Bacillus sp.ZJU318脂肪酶發(fā)酵條件的優(yōu)化及其酶學性質(zhì)的研究[J];科技通報;2006年05期

7 王小艷;馮世江;文先軍;李暉;李春;;真菌產(chǎn)3種β-D-Glucuronidase酶學性質(zhì)[J];生物加工過程;2007年02期

8 馮小海;徐曉瀅;姚忠;徐虹;;Kitasatospora sp.MY 5-36中ε-聚賴氨酸降解酶的純化及酶學性質(zhì)[J];過程工程學報;2007年06期

9 李明春,任勇,張琦,張穎慧,邢來君;甘油氧化酶發(fā)酵條件及酶學性質(zhì)的研究[J];生物技術(shù);2004年04期

10 徐順清;陳杏洲;崔羅生;梁運祥;張忠明;;乳酸克魯維酵母乳糖酶基因在大腸桿菌中的表達及酶學性質(zhì)[J];華中農(nóng)業(yè)大學學報;2010年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 宮國君;楊靜峰;朱蓓薇;;皺紋盤鮑內(nèi)臟β-1,3-葡聚糖酶的提取及其酶學性質(zhì)[A];中國食品科學技術(shù)學會第七屆年會論文摘要集[C];2010年

2 徐曉瀅;馬哲;劉輝;姚忠;;氨基載體EAH sepharose 4B固定化D-海因酶的條件及固定化酶的酶學性質(zhì)[A];第三屆全國化學工程與生物化工年會論文摘要集（上）[C];2006年

3 劉飛;朱希強;郭學平;凌沛學;;獸疫鏈球菌透明質(zhì)酸酶在大腸桿菌中的高效表達和酶學性質(zhì)[A];山東生物化學與分子生物學會2009年學術(shù)會議論文匯編[C];2009年

4 華紹烽;李樹本;辛嘉英;牛建中;夏春谷;;甲基彎菌Methylosinus trichosporium IMV 3011中甲烷單加氧酶的分離純化與酶學性質(zhì)[A];第一屆全國化學工程與生物化工年會論文摘要集(下)[C];2004年

5 胡長浩;施文芳;陳彥;劉燕雅;林琳;;脂肪酶菌種的篩選鑒定及部分酶學性質(zhì)的研究[A];華東六省一市生物化學與分子生物學會2008年學術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2008年

6 吳東林;張玉靜;阮承邁;陳守義;李鵬;歐陽紅生;;端粒酶重復擴增程序(TRAP)的改進和應(yīng)用以及端粒酶酶學性質(zhì)的研究[A];中國生物化學與分子生物學會第八屆會員代表大會暨全國學術(shù)會議論文摘要集[C];2001年

7 吳桂英;吳元欣;趙玉鳳;朱圣東;王存文;池汝安;;破碎酵母釋放乙醇脫氫酶及其酶學性質(zhì)的研究[A];第三屆全國化學工程與生物化工年會論文摘要集（上）[C];2006年

8 李光偉;邱楊;詹少彤;蘭敏;黃偉;周潤華;馮小軍;林濤;肖性龍;;微生物酯酶產(chǎn)生菌的選育、菌株Bacillus sp.EB-87產(chǎn)酶特性及酶學性質(zhì)的研究[A];2006中國微生物學會第九次全國會員代表大會暨學術(shù)年會論文摘要集[C];2006年

9 謝占玲;白占菊;趙朋;余靜;姚陽春;李穎;;分離自青藏高原七株鐮孢菌進化樹及其木聚糖酶與酶學性質(zhì)比較[A];2012年中國菌物學會學術(shù)年會會議摘要[C];2012年

10 彭素萍;王一明;林先貴;朱泓;;產(chǎn)高溫蛋白酶菌株BY25的產(chǎn)酶特性及酶學研究[A];第五次全國土壤生物和生物化學學術(shù)研討會論文集[C];2009年

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 王靜雪;Alteromonas sp.nov. SY37-12菌株產(chǎn)生的瓊膠酶酶學性質(zhì)及酶解產(chǎn)物的分析[D];中國海洋大學;2004年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 李偉;胰蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選、發(fā)酵優(yōu)化及酶學性質(zhì)[D];江南大學;2015年

2 錢國軍;高效合成S-腺苷同型半胱氨酸的雙酶體系及其應(yīng)用的研究[D];南京師范大學;2015年

3 陳飛;CiP在畢赤酵母中的高效表達和純化及部分酶學性質(zhì)[D];福建師范大學;2015年

4 陳宇杰;嗜熱ω-轉(zhuǎn)氨酶的克隆表達及其酶學性質(zhì)的研究[D];華東理工大學;2015年

5 張貝貝;牛瘤胃細菌產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選及其酶學性質(zhì)的研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學;2013年

6 梁冬雪;產(chǎn)耐高溫糖化酶的黑曲霉菌株誘變選育、發(fā)酵條件優(yōu)化及酶學性質(zhì)研究[D];吉林大學;2015年

7 楊雪;麥麩酯酶的制備及其酶學性質(zhì)的研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2015年

8 曾誠;產(chǎn)瓊膠酶菌株的篩選及其酶學性質(zhì)[D];福建農(nóng)林大學;2016年

9 蔣敏麗;γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶學性質(zhì)及其催化應(yīng)用研究[D];廣東藥學院;2011年

10 劉韜;天山凍土低溫淀粉酶產(chǎn)生菌株的篩選及其酶學性質(zhì)的研究[D];石河子大學;2010年

本文編號：2745675