【摘要】：【目的】克隆芽孢桿菌HJ14的酯酶基因Est Z1并利用大腸桿菌表達(dá)得到相應(yīng)的酯酶,分析重組酯酶的酶學(xué)性質(zhì)和對(duì)鄰苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate,DEP)的降解�！痉椒ā刻禺愋詳U(kuò)增酯酶基因Est Z1并對(duì)其全長(zhǎng)測(cè)序,分析其氨基酸序列。利用p EASY-E2表達(dá)系統(tǒng)將Est Z1轉(zhuǎn)化到Escherichia coli BL21(DE3)中完成異源表達(dá)。根據(jù)組氨酸標(biāo)簽純化Est Z1,研究其酶學(xué)性質(zhì)并利用HPLC和LC/MS檢測(cè)系統(tǒng)定性分析其對(duì)DEP的降解�！窘Y(jié)果】Est Z1全長(zhǎng)903 bp,編碼300個(gè)氨基酸殘基,蛋白分子量33.84 k Da。Est Z1氨基酸序列分析結(jié)果顯示,與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的HSL-like家族酯酶相似度最高可達(dá)到98%。酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果顯示,Est Z1可水解碳鏈長(zhǎng)度較短的p-NP底物,最適底物為p-NPC4(p-NP butyrate)。Est Z1的最適p H和最適溫度分別為9.0和50°C,并且在p H 7.0 9.5和40 70°C范圍內(nèi)保持50%以上的酶活,為耐熱堿性酯酶。Est Z1對(duì)多數(shù)金屬離子和化學(xué)試劑保有良好的抗性。Est Z1可將DEP水解生成相應(yīng)的單酯和醇。【結(jié)論】本文報(bào)道了Bacillus sp.HJ14來(lái)源的酯酶基因并對(duì)其在大腸桿菌中表達(dá)獲得的重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,Est Z1具有良好的堿性p H耐受性和熱穩(wěn)定性,能夠部分降解DEP,本研究對(duì)鄰苯二甲酸酯類(lèi)的生物降解有一定的參考意義。
【圖文】：

EstZ1的多序列比對(duì)分析Figure2.MultiplesequencealignmentofEstZ1.SequencesretrievedfromtheNCBIserverwerealignedinCLUSTALWandrenderedusingESPriptoutput.Sequencesaregroupedaccordingtosimilarity.EstZ1fromBacillussp.HJ14;3AIKfromFerroplasma;KPN14852fromBacillussp.NH7I_1;AAG09918fromBacilluspumilus;KOO40129fromBacillusokuhidensis;KOS02876fromPaenibacilluspolymyxa;five-pointedstarindicateaminoacidresiduesbelongingtothecatalyt

X-100對(duì)EstZ1的活性有部分促進(jìn)(大約11.1% 46.5%)；Na+，Pb2+，Mn2+，Ni2+，Cu2+，methylalcohol，acetone對(duì)EstZ1的活性影響較小(保持在88.0% 105.5%)；Co2+，Hg2+，SDS，β-mercaptoethanol，Tween-80，Ethylalcohol對(duì)EstZ1的活性有部分抑制(大約15.3% 78.8%)。其中可破壞二硫鍵的β-mercaptoethanol對(duì)EstZ1有強(qiáng)烈抑制，說(shuō)明二硫鍵對(duì)于EstZ1的穩(wěn)定性和活性有較大影響。2.5EstZ1對(duì)鄰苯二甲酸二乙酯的降解HPLC分析結(jié)果顯示鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)標(biāo)品的保留時(shí)間為5.080(圖5-A)，產(chǎn)物中除圖3.純化酶EstZ1的SDS-PAGE分析Figure3.PurificationofEstZ1.Lane1:totalproteinsofE.coliBL21(DE3)withblankvectorpEASY-E2;Lane2:totalproteinsofE.coliBL21(DE3)harboringtherecombinantplasmidpEASY-E2-EstZ1;Lane3:purifiedEstZ1;LaneM:proteinmolecularweightmarker.圖4.純化酶EstZ1的酶學(xué)特性Figure4.TheenzymaticcharacteristicsofpurifiedEstZ1.A:EffectofpHonEstZ1activity.Reactionswereperformedindifferentbufferswiththeconcentrationof50mmol/Lrangefrom5.0 11.0(McIlvainebufferforpH5.0 8.0,Tris-HClbufferforpH7.0 9.0andBoratebufferforpH9.0 11.0)at37°C,respectively.B:pHstabilityofEstZ1.Theenzymewasincubatedfor1hinbuffersofvariouspHvalues(pH2.0 12.0)at37°C.C:EffectoftemperatureonEstZ1activitywasdeterminedusingp-NPC4assubstrateinthetemperaturerangeof0°Cto95°CinTris-HClbuffer(50mmol/L,pH9.0).D:ThermostabilityofEstZ1.Theenzymewasincubatedfor1hat37°C,60°Cand80°C.1938ZhengPengetal.|ActaMicrobiologicaSinica,2016,56(12)actamicro@im.ac

了在相同的保留時(shí)間出現(xiàn)峰還出現(xiàn)了新的峰，表明產(chǎn)物中除了DEP(分子量222)還有新物質(zhì)生成(圖5-B)。酯酶水解鄰苯二甲酸酯類(lèi)的降解途徑為酯鍵逐個(gè)水解或者同時(shí)水解(圖6)，所以DEP的可能降解產(chǎn)物有鄰苯二甲酸單乙酯(MEP，分子量194)和鄰苯二甲酸(PTH，分子量166)。LC/MS的分析結(jié)果顯示，可以得到加Na+的分子離子峰m/z為245(圖7-A)，減H+的分子離子峰m/z為193(圖7-B)，根據(jù)分子量推算可以推測(cè)出EstZ1水解DEP可生成MEP。表3.金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)EstZ1的活力影響Table3.EffectofvariousmetalionsandchemicalagentsonenzymeactivityReagentsConcentrateRelativeactivity/%None0mmol/L100.0±0.4Ag+1mmol/L113.2±0.7Ca2+1mmol/L93.1±0.1K+1mmol/L85.8±0.4Fe2+1mmol/L111.2±0.3Zn2+1mmol/L34.0±0.2Mg2+1mmol/L91.5±0.4Na+1mmol/L103.0±0.2Mn2+1mmol/L93.7±0.3Fe3+1mmol/L146.5±0.0Pb2+1mmol/L88.0±0.1Ni2+1mmol/L103.1±0.9Co2+1mmol/L84.7±0.1Cu2+1mmol/L105.5±0.4Hg2+1mmol/L39.7±0.1Al3+1mmol/L128.3±0.3EDTA1mmol/L125.8±0.2SDS1mmol/L60.4±1.0β-mercaptoethanol1mmol/L21.2±0.1TritonX-1001%V/V111.1±0.1Tween-801%V/V67.1±0.7Methylalcohol1%V/V91.4±0.5Alcohol1%V/V75.1±0.4Acetone1%V/V95.4±0.5圖5.HPLC分析結(jié)果Figure5.TheresultsofHPLCanalyses.A:DEPstandardsample.B:TheresultsofDEPdegradationafterincubationwithEstZ1.圖6.酯酶對(duì)鄰苯二甲酸酯水解Figure6.DegradationofPAEsbyesterase.彭政等|微生物學(xué)報(bào),2016,56(12)1939http://journals.im.ac.cn/actamicrocn

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