【摘要】：目的:采用雞胚染毒實驗模型探討孵育雞胚暴露于不同劑量的PM2.5后對雞胚心臟和肝臟發(fā)育的毒性作用及其分子機制,為PM2.5暴露對子代心臟和肝臟發(fā)育的毒性機制提供一定的理論依據(jù)。方法:210只受精雞蛋,其中第一批120只雞蛋根據(jù)雞蛋重量隨機分為6組,PM2.5劑量分別為0、0.05、0.2、0.5、2和5mg/kg。根據(jù)第一批雞胚實驗結(jié)果,對第二批雞胚實驗的分組(90只雞蛋)進行了調(diào)整,除去PM2.5為0.05mg/kg和5mg/kg劑量組,共分為4組,PM2.5劑量分別為0、0.2、0.5、2mg/kg。對雞蛋表面進行消毒和氣室注射染毒,隨后放入孵箱中進行孵化,兩批雞胚的孵化條件完全相同。在雞胚孵育4天和15天時,分別對各PM2.5劑量組的雞胚進行采樣,觀察雞胚心臟的發(fā)育情況并測量4天雞胚心臟面積和15天雞胚心臟橫切面積。在雞胚孵化后,對孵化幼雞的心率進行測量,并對孵化幼雞的肝功能血清學指標進行測量。采用HE染色觀察孵化幼雞心臟和肝臟的病理,并測量右心壁厚度。采用免疫組化檢測孵化幼雞心臟和肝臟組織NF-kB p65蛋白的表達,采用Western blot檢測孵化幼雞心臟和肝臟組織iNOS和MMP9蛋白的表達。結(jié)果:(1)孵育雞胚暴露于PM2.5后,可導致孵育4天雞胚的心臟面積和15天雞胚的心臟橫切面積明顯增大,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)與對照組孵育雞胚生存率相比,5mg/kg PM2.5組雞胚的生存率明顯降低,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)孵化幼雞的心率測量結(jié)果表明,與對照組相比,孵育雞胚暴露于PM2.5后可導致孵化幼雞心率明顯加快,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(4)孵化幼雞心臟的HE染色結(jié)果顯示,與對照組相比,孵育雞胚暴露于PM2.5后可導致孵化幼雞的右心壁厚度明顯增加,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);孵化幼雞肝臟的HE染色結(jié)果顯示,孵育雞胚暴露于PM2.5后可導致孵化幼雞發(fā)生肝臟脂肪變和肝臟炎性細胞浸潤增加。(5)肝功能檢測結(jié)果表明,與對照組相比,0.5mg/kg和2mg/kg PM2.5組孵化幼雞血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Cereal third transaminase,ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)水平明顯增加,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(6)各PM2.5劑量組孵化幼雞的心臟和肝臟免疫組化結(jié)果顯示,與對照組相比,0.5mg/kg和2mg/kg PM2.5組孵化幼雞心臟和肝臟組織中的NF-Kb p65蛋白的表達發(fā)生了明顯上調(diào),且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(7)孵化幼雞心臟和肝臟Western blot檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,在0.2mg/kg和0.5mg/kg PM2.5劑量組孵化幼雞心臟中的iNOS和MMP9蛋白表達均明顯上調(diào),且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),但在2mg/kg劑量下,心臟組織中的iNOS和MMP9蛋白表達水平未升高,整體呈倒U型量效曲線;在肝臟組織中,與對照組相比,iNOS和MMP9蛋白表達均明顯上調(diào),且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:PM2.5暴露對發(fā)育雞胚的心臟具有損傷作用,可導致發(fā)育雞胚的心臟橫切面積增大、幼雞右心壁增厚和心率升高,并可引發(fā)肝臟脂肪變及炎癥樣損傷,提示發(fā)育雞胚暴露于PM2.5后對孵化幼雞心臟和肝臟的發(fā)育具有潛在的風險。此外,PM2.5暴露可誘導孵化幼雞心臟和肝臟組織中的NF-kB p65、iNOS以及MMP9的表達水平顯著升高,提示炎癥反應可能為PM2.5暴露導致發(fā)育雞胚心臟和肝臟組織損傷的作用機制之一。
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R114;X513
【圖文】：

（3）將孵化 1 天的幼雞心臟和肝臟組織剪碎并研磨后加入 100μL 裂解液，充漿。（4）在冰上放置 30min，使其充分裂解，每 10min 充分振蕩一次，隨后放入離心機 4℃離心（14000g, 5 min），取上清液，儲存在-20℃冰箱備用。1.2 蛋白濃度測定孔酶標儀法（1）配制工作液: 根據(jù)標準品和樣品數(shù)量，按 50 體積 BCA 試劑加 1 體積 C（50:1）配制成 BCA 工作液，充分混勻（混合時可能會有渾濁，但混勻后就會）。（2）稀釋標準品：將標準品按 0, 2, 4，6，8, 12, 16, 20μL 加到 96 孔板的蛋白品孔中，加 PBS 補足到 20μL。（3）將樣品以 1:5 倍稀釋，加 20μL 稀釋液到 96 孔板的樣品孔中。（4）每孔加入 200μL BCA 工作液，37℃放置 15-30min。用酶標儀測定 A562據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。使用溫箱孵育時，應注意防止因水分蒸發(fā)影響檢測。（圖 1 和圖 2 分別為本實驗 BCA 法得到的心臟和肝臟組織的蛋白濃度標準曲線

圖 2 肝臟組織蛋白濃度標準曲線1.3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）選擇潔凈的玻璃板夾槽，在其中加入 10%分離膠置灌膠板，用雙蒸水封膠，，避免產(chǎn)生氣泡。靜置，待 30min 分離膠凝固后再加入 5%濃縮膠，玻璃板1.0mm 的梳子，待其 40min 凝固后將其浸于電泳緩沖液并拔出梳子；根據(jù) BC所示樣品蛋白濃度，取適量待測樣品蛋白，以 PBS 調(diào)整濃度至相等，與 5×液按 4:1 的體積比混合，95℃變性 5min 后，每孔上樣 10μL（50μg），濃縮壓 80V，分離膠所加電壓 120V，進行恒壓電泳。打開電泳儀開關(guān)，將電壓，待蛋白樣品進入分離膠后（出現(xiàn) Marker 條帶），將電壓調(diào)至 120V。待藍色底部時，關(guān)掉電源，電泳的時間一般為 1h 15min 左右。1.4 轉(zhuǎn)膜準備與凝膠同樣大小的 PVDF 膜和濾紙， PVDF 膜預先在甲醇中激活 1min ，然后和濾紙、海綿一起放入轉(zhuǎn)膜液中浸泡 2min。轉(zhuǎn)膜夾芯板正極在下，次放置海綿墊、濾紙、PVDF 膜、凝膠、濾紙、海綿墊，250mA 恒流轉(zhuǎn)膜 1h 451.5 抗原抗體反應

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本文編號：2741573