發(fā)布時間：2020-06-14 11:01

【摘要】：目的:生態(tài)環(huán)境部和國土資源部調(diào)查發(fā)現(xiàn),鎘污染是目前中國污染最嚴重也是污染面積最大的重金屬污染。植物既是重金屬流入人體最主要的途徑之一,也是開展重金屬污染土壤植物修復工程最關(guān)鍵的載體。油菜(Brassica campestris L.)是典型的鎘超富集植物之一,具有生長周期短、生物量大、適應性強的優(yōu)點。根是植物接觸重金屬污染物的主要器官,也是第一個開始應激反應的位點。轉(zhuǎn)基因毛狀根在生理上十分接近真正的根,并且具有生長迅速、生物量大、培養(yǎng)不受季節(jié)限制、可以排除根際微生物影響等優(yōu)點。因此本論文以轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根為實驗材料,對其在不同鎘濃度和時間脅迫下的生理響應特性、鎘及必需元素的富集能力進行研究,通過生物信息學策略綜合分析轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根響應鎘脅迫的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù),挖掘轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根響應鎘脅迫的關(guān)鍵基因和代謝通路,為后續(xù)的油菜毛狀根轉(zhuǎn)基因改造以及構(gòu)建實用型鎘超富集油菜提供理論依據(jù)。方法:本論文以A4農(nóng)桿菌誘導的轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根為實驗材料,利用MS培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的方法建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根體系。對轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根在不同鎘濃度(0,25,50,100,200,400 μmol/L)和時間(1d和7 d)脅迫下的生理響應進行檢測,檢測指標包括生長狀況、生物量、活性氧(reactive oxygen species,ROS)積累、抗氧化酶活力的變化、細胞凋亡以及鎘與其他必需元素的含量;并且經(jīng)統(tǒng)計學分析確定轉(zhuǎn)錄組測序的最適鎘處理濃度和時間。利用二代測序技術(shù)將轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根在鎘脅迫前后的轉(zhuǎn)錄組進行了檢測,綜合利用生物信息學方法分析鎘脅迫前后的轉(zhuǎn)錄組差異,篩選出差異表達的基因,進行Gene Ontoloty(GO)功能和KEGG Pathway富集分析,對部分基因進行RNA水平的Real Time PCR驗證,對關(guān)鍵通路中的基因進行蛋白質(zhì)水平的驗證。結(jié)果:轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根在30 d的生長周期里,依次經(jīng)歷了前10 d的對數(shù)生長期、中間10 d的穩(wěn)定期和后10 d的衰老期。鎘脅迫實驗的結(jié)果表明,低鎘濃度(100μmol/L以下)對毛狀根的生長無顯著影響,高鎘濃度(100μmol/L以上)下毛狀根的生長則受到明顯的抑制,鎘濃度為25 μmol/L鎘脅迫7 d時,毛狀根的鮮重最大(4.34 g)。轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根中ROS的含量隨著鎘濃度的增加而上升,根中主要抗氧化酶(superoxide dismutase,SOD;peroxidase,POD;catalase,CAT)的活力在鎘脅迫1d時,表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢;在鎘脅迫7d時,表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色與丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量分析表明,根細胞的損傷隨著鎘濃度的增加越發(fā)嚴重。轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根中的鎘含量隨著培養(yǎng)基中鎘濃度的增加而增加,400μmol/L、7 d時,達到最大值2.97 mg/g。毛狀根中的鐵含量在鎘脅迫1 d時隨著鎘濃度的增加顯著上升,最大值達到14.52 mg/g;鎘脅迫7 d時沒有明顯變化。鎘脅迫7 d時毛狀根中的鉀含量是鎘脅迫1d時(15.73 mg/g)的1.6倍。研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根對鎘脅迫的生理響應變化與鎘的作用濃度和時間相關(guān);同時鎘脅迫造成了毛狀根中鐵、鉀元素代謝紊亂,但轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根對鎘有較好的富集效果。統(tǒng)計學分析結(jié)果表明濃度為200 μmol/L的鎘脅迫1 d時轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根與對照組的差異較顯著,適合進行轉(zhuǎn)錄組學測序(p0.05)。RNA質(zhì)檢顯示,RNA質(zhì)量良好,總量滿足2次或者2次以上的建庫需要,滿足轉(zhuǎn)錄組測序建庫要求。平均每個樣品的比對率達到64.97%,樣品間的均勻比對率表明樣品之間的數(shù)據(jù)具有可比性。相關(guān)性和聚類分析結(jié)果顯示,處理組與對照組的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)達到96%以上。DEseq2統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)有1564個基因上調(diào),830個基因下調(diào)。通過GO功能分類及富集分析和KEGG生物通路分類及富集分析,找出了 8個顯著富集在細胞刺激的響應的GO terms和6個顯著富集的Pathways。根據(jù)GO信息、Pathway信息相關(guān)性和FC值大小,選擇其中8個顯著差異表達基因(103845713、103874543、103835040、103872346、103875293、103867458、103855019、103870505)進行RealTimePCR驗證,結(jié)果顯示這8個基因的轉(zhuǎn)錄水平與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果一致。Western Blotting實驗結(jié)果顯示,鎘脅迫造成了轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根中谷胱甘肽合成酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的大量表達。結(jié)論:轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根可以替代完整植株的根系進行重金屬鎘脅迫的研究,轉(zhuǎn)錄組測序和Western Blotting實驗結(jié)果提示谷胱甘肽合成酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根響應鎘脅迫的過程中發(fā)生了重要的作用。
【學位授予單位】：北京交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：X171.5;S565.4
【圖文】：

邐Ｈｉ逡逑需元素的轉(zhuǎn)運蛋白或通道，這些轉(zhuǎn)運蛋白或離子通道對于陽離子沒有選擇性或者逡逑特異性較低［１７］。鎘離子的吸收與轉(zhuǎn)運主要涉及以下相關(guān)蛋白（圖１－１），主要包括逡逑ＮＲＡＭＰ家族、Ｐ－ｔｙｐｅＡＴＰａｓｅ、ＡＢＣ轉(zhuǎn)運蛋白、ＣＡＸ家族、ＺＩＰ家族、ＬＣＴ轉(zhuǎn)運逡逑蛋白、ＣＥ家族、ＹＳＬ家族［１８＿１９］。逡逑▲逡逑＾邋Ｖａｃｕｏｌｅ邐Ｖａｃｕｏｌｅ邐ＭＴＰ１逡逑Ｃｄ、秦邋Ｃｄ２＋逡逑＞邐（邋ｆｉ２＊邐ＰＣ－ＣＭ逡逑Ｎｒａｍｐ３邋｜Ｎｒａｍｐ４邐S緬澹齲停鈴澹沖�，Ａn�？逦Ｉ：壤辶x希校茫茫溴�？邋Ｎ｀嶄ｉｎ７w靛�？逦了逦ＰＣ－Ｃｄ辶x希煎澹矗繡澹校茫茫椋戾味危茫溴危徨義希懾危裕校緬澹螅睿簦瑁幔螅邋義希茫洌蓿歟洌幔歟�？�

本文編號：2712684