【摘要】：目的:生態(tài)環(huán)境部和國(guó)土資源部調(diào)查發(fā)現(xiàn),鎘污染是目前中國(guó)污染最嚴(yán)重也是污染面積最大的重金屬污染。植物既是重金屬流入人體最主要的途徑之一,也是開展重金屬污染土壤植物修復(fù)工程最關(guān)鍵的載體。油菜(Brassica campestris L.)是典型的鎘超富集植物之一,具有生長(zhǎng)周期短、生物量大、適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。根是植物接觸重金屬污染物的主要器官,也是第一個(gè)開始應(yīng)激反應(yīng)的位點(diǎn)。轉(zhuǎn)基因毛狀根在生理上十分接近真正的根,并且具有生長(zhǎng)迅速、生物量大、培養(yǎng)不受季節(jié)限制、可以排除根際微生物影響等優(yōu)點(diǎn)。因此本論文以轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根為實(shí)驗(yàn)材料,對(duì)其在不同鎘濃度和時(shí)間脅迫下的生理響應(yīng)特性、鎘及必需元素的富集能力進(jìn)行研究,通過(guò)生物信息學(xué)策略綜合分析轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根響應(yīng)鎘脅迫的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù),挖掘轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根響應(yīng)鎘脅迫的關(guān)鍵基因和代謝通路,為后續(xù)的油菜毛狀根轉(zhuǎn)基因改造以及構(gòu)建實(shí)用型鎘超富集油菜提供理論依據(jù)。方法:本論文以A4農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根為實(shí)驗(yàn)材料,利用MS培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的方法建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根體系。對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根在不同鎘濃度(0,25,50,100,200,400 μmol/L)和時(shí)間(1d和7 d)脅迫下的生理響應(yīng)進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)指標(biāo)包括生長(zhǎng)狀況、生物量、活性氧(reactive oxygen species,ROS)積累、抗氧化酶活力的變化、細(xì)胞凋亡以及鎘與其他必需元素的含量;并且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的最適鎘處理濃度和時(shí)間。利用二代測(cè)序技術(shù)將轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根在鎘脅迫前后的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了檢測(cè),綜合利用生物信息學(xué)方法分析鎘脅迫前后的轉(zhuǎn)錄組差異,篩選出差異表達(dá)的基因,進(jìn)行Gene Ontoloty(GO)功能和KEGG Pathway富集分析,對(duì)部分基因進(jìn)行RNA水平的Real Time PCR驗(yàn)證,對(duì)關(guān)鍵通路中的基因進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的驗(yàn)證。結(jié)果:轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根在30 d的生長(zhǎng)周期里,依次經(jīng)歷了前10 d的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、中間10 d的穩(wěn)定期和后10 d的衰老期。鎘脅迫實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,低鎘濃度(100μmol/L以下)對(duì)毛狀根的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響,高鎘濃度(100μmol/L以上)下毛狀根的生長(zhǎng)則受到明顯的抑制,鎘濃度為25 μmol/L鎘脅迫7 d時(shí),毛狀根的鮮重最大(4.34 g)。轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根中ROS的含量隨著鎘濃度的增加而上升,根中主要抗氧化酶(superoxide dismutase,SOD;peroxidase,POD;catalase,CAT)的活力在鎘脅迫1d時(shí),表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì);在鎘脅迫7d時(shí),表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色與丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量分析表明,根細(xì)胞的損傷隨著鎘濃度的增加越發(fā)嚴(yán)重。轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根中的鎘含量隨著培養(yǎng)基中鎘濃度的增加而增加,400μmol/L、7 d時(shí),達(dá)到最大值2.97 mg/g。毛狀根中的鐵含量在鎘脅迫1 d時(shí)隨著鎘濃度的增加顯著上升,最大值達(dá)到14.52 mg/g;鎘脅迫7 d時(shí)沒有明顯變化。鎘脅迫7 d時(shí)毛狀根中的鉀含量是鎘脅迫1d時(shí)(15.73 mg/g)的1.6倍。研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根對(duì)鎘脅迫的生理響應(yīng)變化與鎘的作用濃度和時(shí)間相關(guān);同時(shí)鎘脅迫造成了毛狀根中鐵、鉀元素代謝紊亂,但轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根對(duì)鎘有較好的富集效果。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明濃度為200 μmol/L的鎘脅迫1 d時(shí)轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根與對(duì)照組的差異較顯著,適合進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序(p0.05)。RNA質(zhì)檢顯示,RNA質(zhì)量良好,總量滿足2次或者2次以上的建庫(kù)需要,滿足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序建庫(kù)要求。平均每個(gè)樣品的比對(duì)率達(dá)到64.97%,樣品間的均勻比對(duì)率表明樣品之間的數(shù)據(jù)具有可比性。相關(guān)性和聚類分析結(jié)果顯示,處理組與對(duì)照組的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)達(dá)到96%以上。DEseq2統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)有1564個(gè)基因上調(diào),830個(gè)基因下調(diào)。通過(guò)GO功能分類及富集分析和KEGG生物通路分類及富集分析,找出了 8個(gè)顯著富集在細(xì)胞刺激的響應(yīng)的GO terms和6個(gè)顯著富集的Pathways。根據(jù)GO信息、Pathway信息相關(guān)性和FC值大小,選擇其中8個(gè)顯著差異表達(dá)基因(103845713、103874543、103835040、103872346、103875293、103867458、103855019、103870505)進(jìn)行RealTimePCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示這8個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果一致。Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,鎘脅迫造成了轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根中谷胱甘肽合成酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的大量表達(dá)。結(jié)論:轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根可以替代完整植株的根系進(jìn)行重金屬鎘脅迫的研究,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示谷胱甘肽合成酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在轉(zhuǎn)基因油菜毛狀根響應(yīng)鎘脅迫的過(guò)程中發(fā)生了重要的作用。
【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：X171.5;S565.4
【圖文】：

邐Ｈｉ逡逑需元素的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或通道，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或離子通道對(duì)于陽(yáng)離子沒有選擇性或者逡逑特異性較低［１７］。鎘離子的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)主要涉及以下相關(guān)蛋白（圖１－１），主要包括逡逑ＮＲＡＭＰ家族、Ｐ－ｔｙｐｅＡＴＰａｓｅ、ＡＢＣ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、ＣＡＸ家族、ＺＩＰ家族、ＬＣＴ轉(zhuǎn)運(yùn)逡逑蛋白、ＣＥ家族、ＹＳＬ家族［１８＿１９］。逡逑▲逡逑＾邋Ｖａｃｕｏｌｅ邐Ｖａｃｕｏｌｅ邐ＭＴＰ１逡逑Ｃｄ、秦邋Ｃｄ２＋逡逑＞邐（邋ｆｉ２＊邐ＰＣ－ＣＭ逡逑Ｎｒａｍｐ３邋｜Ｎｒａｍｐ４邐S緬澹齲停鈴澹沖�，Ａn�？逦Ｉ：壤辶x希校茫茫溴�？邋Ｎ｀嶄ｉｎ７w靛�？逦了逦ＰＣ－Ｃｄ辶x希煎澹矗繡澹校茫茫椋戾味危茫溴危徨義希懾危裕校緬澹螅睿簦瑁幔螅邋義希茫洌蓿歟洌幔歟�？�

本文編號(hào)：2712684