【摘要】：在自然環(huán)境中,飲用水水源很容易受到病原微生物的侵染,被污染的水體中,通常能檢測(cè)出大量的致病菌和腸道病毒。大腸桿菌作為水源中病原菌的標(biāo)準(zhǔn)指示菌,對(duì)水質(zhì)安全監(jiān)測(cè)具有重要意義,我國(guó)國(guó)標(biāo)GB5749-2006生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中嚴(yán)格規(guī)定：飲用水的大腸桿菌限值為每1 OOmL不得檢出。然而,目前大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法仍以傳統(tǒng)檢測(cè)方法為主,這些檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣,不適合對(duì)水樣進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。如何快速準(zhǔn)確檢測(cè)出水體中大腸桿菌稱為人們研究的熱點(diǎn)。本論文圍繞大腸桿菌快速檢測(cè)來(lái)展開(kāi)研究工作,選取高特異性、高靈敏度的PCR和具有準(zhǔn)確定量的FRET原理來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)。首先建立普通PCR法。選取大腸桿菌的特異性保守性基因uidA作為目標(biāo)檢測(cè)物,對(duì)uidA進(jìn)行引物設(shè)計(jì)后進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn),在保證引物的特異性和準(zhǔn)確性后克隆成質(zhì)粒,并根據(jù)質(zhì)粒對(duì)PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行篩選和調(diào)控,最后得到最佳的PCR擴(kuò)增條件。然后建立QDs-Cy5基的FRET檢測(cè)體系。選取反應(yīng)條件溫和的水相回流法來(lái)合成CdTe量子點(diǎn),通過(guò)調(diào)節(jié)回流時(shí)間得到一系列發(fā)光效率較好的量子點(diǎn)。選取量子產(chǎn)率為53%、發(fā)射在602 nm的CdTe量子點(diǎn)為FRET的供體,根據(jù)Forster原理對(duì)比量子點(diǎn)與染料的吸收和發(fā)射光譜,選取在600 nm左右有較強(qiáng)吸收的花菁染料Cy5作為FRET的受體。根據(jù)目的DNA設(shè)計(jì)的一組適配子,與供受體對(duì)連接后形成捕獲探針和報(bào)告探針,兩組探針可與目的DNA特異性結(jié)合形成夾心結(jié)構(gòu)并通過(guò)FRET來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目的DNA的檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)中可能影響的因素進(jìn)行適當(dāng)調(diào)控后,成功對(duì)uidA基因進(jìn)行了檢測(cè),其檢測(cè)限為2nmol/L,且在2nmol/L-100 nmol/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,線性系數(shù)為0.999。最后聯(lián)立PCR-FRET,其可在3h內(nèi)完成對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)。對(duì)uidA基因的檢測(cè)結(jié)果顯示其可檢測(cè)到30copies的uidA,比普通PCR法的檢測(cè)限約低一個(gè)數(shù)量級(jí)；該方法可檢測(cè)大腸桿菌濃度在103-107 CFU/mL范圍內(nèi)的水樣,最后對(duì)實(shí)際水樣進(jìn)行了檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果與平板法和普通PCR法結(jié)果相一致,但準(zhǔn)確度還有待進(jìn)一步提高。
【圖文】：

是Ｍｉｌｌｕｓ和Ｃｅｔｕｓ于１９８３年在Ｓｃｉｅｎｃｅ雜志上發(fā)表的一種體外ＤＮＡ快速擴(kuò)增技術(shù)，其逡逑模擬生物體內(nèi)ＤＮＡ復(fù)制過(guò)程，Ｗ目的ＤＮＡ為模板，在ＤＮＡ聚合酶的作用下，使ＤＮＡ逡逑數(shù)量呈指數(shù)形式增加。其原理分為Ｈ個(gè)步驟（如圖１．１所示）。逡逑第一步高溫變性，，在９０－９６°Ｃ較高溫度下，雙鏈ＤＮＡ（Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ邋ＤＮＡ，ｄｓＤＮＡ）逡逑中的氨鍵斷裂，解旋為兩條單鏈ＤＮＡ邋（Ｓ虹ｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡ，ｓｓＤＮＡ）；逡逑第二步低溫退火，在４５－６５°Ｃ較低溫度下，引物根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，與兩條模逡逑板ＤＮＡ結(jié)合形成局部雜交鏈；逡逑第Ｈ步中溫延伸，在７０－７５‘Ｃ時(shí)，耐熱ＤＮＡ聚合酶４種核巧酸（腺V蚜牒飼傷徨義希洌粒裕�、胸腺锣y珊飼傷幔洌裕裕�、鸟嘿吟猴晜ｄ吭Ｐ、胞鄬\宋羲幔洌茫裕校┪瓘/，從逡逑引物的３’端開(kāi)始，｛＾目的０？八單鏈為模板，從５’－３’的方向合成互補(bǔ)鏈。逡逑經(jīng)過(guò)這三個(gè)步驟（一個(gè)熱循環(huán)）后，一個(gè)ｄｓＤＮＡ分子擴(kuò)增為２個(gè)具有同樣堿基序逡逑列的ｄｓＤＮＡ分子。隨著Ｈ個(gè)步驟的循環(huán)往復(fù)

量轉(zhuǎn)移給染料，使得ＤＮＡ－染料復(fù)合物發(fā)射的英光強(qiáng)度比游離的染料發(fā)射的巧光強(qiáng)度大逡逑得多。常用的核酸染料巧澳化乙錠化出ｉｄｉｕｍ邋Ｂｒｏｍｉｄｅ，ＥＢ）、ＳＹＢＲ邋Ｇｒｅｅｎ邋Ｉ和ＧｅｌＲｅｄ逡逑等，巧中，ＥＢ與ＤＮＡ的結(jié)合如圖１．２所示。Ｑｉｎｇ邋ｔｉｕａｎｇ等人Ｐ７哺Ｍ．Ｃ．Ｍ．邋Ｃｏｕｔｏ等人逡逑ｐｓｊ比較了邋ＥＢ、ＳＹＢ民Ｇｒｅｅｎ邋Ｉ和ＧｅｌＲｅｄ三種核酸染料對(duì)ＰＣ民凝膠電泳結(jié)果的影響，結(jié)逡逑果顯示：靈敏度說(shuō)化６（１＞５￥８１１６化６１１１＞￡８，且0６１民６（］不僅靈敏度較其他二者高，而逡逑且穩(wěn)定性好、對(duì)化物體毒性較小。逡逑－８邋－逡逑
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TU991.21;X832

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2702154