【摘要】：隨著工業(yè)的發(fā)展,大氣顆粒物污染越來越嚴(yán)重,給人類健康造成極大危害。PM2.5是指空氣動(dòng)力學(xué)直徑"f2.5微米的大氣懸浮顆粒物,主要來自煤炭燃燒、機(jī)動(dòng)車尾氣及工業(yè)廢氣的排放等過程,是形成霧霾天氣的主要原因。目前認(rèn)為PM2.5毒性機(jī)理主要包括以下可能機(jī)制,PM2.5首先與肺上皮細(xì)胞作用,刺激后釋放各種細(xì)胞因子,PM2.5還能進(jìn)一步與細(xì)胞作用,釋放活性氧自由基等,氧化損傷組織細(xì)胞。氣道炎癥發(fā)生的早期是以支氣管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)開始的,炎癥因子的改變則是PM2.5致炎癥作用的主要原因之一。為推動(dòng)我國大氣污染與人體健康關(guān)系的研究,開展PM2.5的毒性機(jī)制研究是必要且迫切。本研究以Beas-2B細(xì)胞為研究對(duì)象,考察PM2.5對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞的毒性作用與機(jī)制,采用MTT比色法檢測(cè)不同濃度下PM2.5對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制情況;在顯微鏡下觀察PM2.5對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響;通過NO、ROS熒光探針實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PM2.5毒染細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)NO和ROS氧化應(yīng)激水平的變化;通過Hoechst33258實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的PM2.5對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)情況影響。為進(jìn)一步研究PM2.5及其主要多環(huán)芳烴類成分熒蒽、芘及菲對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞的損傷作用和機(jī)制,選用PM2.5主要成分熒蒽、芘及菲為研究對(duì)象,采用MTT比色法檢測(cè)不同濃度下熒蒽、芘、菲對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制情況;利用Real-Time PCR檢測(cè)其毒染細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)炎癥因子和白細(xì)胞介素相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響;應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)其處理細(xì)胞后炎癥因子相關(guān)信號(hào)通路NF-κB、p38MAPK及和Nrf2表達(dá)和信號(hào)通路激活作用,同時(shí)檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白p53、Bcl2、Bax和caspase1、3、12的表達(dá)情況。最后,為闡明PM2.5的主要多環(huán)芳烴類成分熒蒽和芘在體內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制,以BSA為蛋白模型,采用紫外光譜法研究熒蒽,芘與BSA作用后BSA蛋白質(zhì)中芳香族殘基微環(huán)境的變化以及BSA分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化;采用熒光光譜法研究熒蒽、芘與BSA的相互作用及分子構(gòu)象,通過公式計(jì)算熒蒽,芘與BSA距離,判斷是否鑲嵌到BSA分子內(nèi)部;采用同步熒光光譜法測(cè)量最大發(fā)射波長(zhǎng)的改變,研究檢測(cè)熒蒽、及芘與BSA的相互作用后氨基酸殘基的環(huán)境的相應(yīng)變化;采用三維熒光光譜法描述酪氨酸和色氨酸殘基的結(jié)構(gòu)變化和多肽鏈結(jié)構(gòu)的變化,判斷熒蒽、芘在BSA分子內(nèi)部的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果表明,PM2.5可以顯著抑制細(xì)胞增殖能力并存在劑量依賴性關(guān)系。鏡下觀察通過不同劑量PM2.5處理后的細(xì)胞形態(tài)從梭形變成圓形,細(xì)胞出現(xiàn)皺縮且細(xì)胞數(shù)目隨濃度增加明顯減少。并且隨著PM2.5濃度的增加,細(xì)胞內(nèi)NO和ROS熒光強(qiáng)度明顯增加,表明PM2.5使氧化應(yīng)激程度增加。Hoechst33258和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PM2.5可以有效的誘導(dǎo)Beas-2B細(xì)胞的凋亡,并存在一定的濃度依賴。Real Time PCR檢測(cè)結(jié)果表明,PM2.5、熒蒽、芘及菲處理后細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)因子及白細(xì)胞介素表達(dá)均上調(diào),表明PM2.5、熒蒽、芘及菲均能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,PM2.5可以激活p38MAPK、NF-κB通路,抑制Nrf2信號(hào)通路。研究還發(fā)現(xiàn),熒蒽、芘、菲均的結(jié)果具有和PM2.5相同趨勢(shì)僅部分凋亡相關(guān)蛋白未檢測(cè)能夠誘導(dǎo)炎癥相關(guān)因子的表達(dá),激活p38MAPK、NF-κB通路,抑制Nrf2信號(hào)通路。光譜研究表明,加入熒蒽和芘后分子內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸殘基的疏水基團(tuán)裸露同時(shí)BSA肽鏈伸展,紫外光譜表現(xiàn)為明顯的增色效應(yīng)以及改變了BSA分子的二級(jí)結(jié)構(gòu);熒光猝滅機(jī)制的探討中通過Stern-Volmer方程計(jì)算出熒蒽和芘對(duì)BSA的結(jié)合特性均為靜態(tài)猝滅,并且隨著溫度升高結(jié)合點(diǎn)和平衡常數(shù)均有下降也符合靜態(tài)猝滅機(jī)制,再根據(jù)Forster的非輻射能量轉(zhuǎn)移理論,計(jì)算出熒蒽和芘與BSA相互作用后與色氨酸之間結(jié)合距離r和能量轉(zhuǎn)移效率E,二者與BSA色氨酸之間的結(jié)合距離r,表明它們之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的可能性很高。通過熱力學(xué)公式計(jì)算在不同溫度條件下,FLA-BSA和PYR-BSA的ΔG、ΔH、ΔS,并判斷出表明相互作用力均是疏水作用。再通過同步熒光光譜法判斷FLA和PYR對(duì)BSA中發(fā)光熒光團(tuán)酪氨酸殘基微區(qū)和色氨酸殘基微區(qū)的影響。最后使用三維熒光光譜法確定結(jié)合位點(diǎn)是在BSA疏水腔,導(dǎo)致了疏水性微環(huán)境極性改變,最終引起B(yǎng)SA構(gòu)象變化。綜上所述,PM2.5及其主要的多環(huán)芳烴成分還可以導(dǎo)致細(xì)胞的毒性作用,并且能引發(fā)致炎癥作用,激活p38MAPK、NF-κB通路,抑制Nrf2信號(hào)通路,PM2.5的部分成分在體內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制是通過與BSA結(jié)合實(shí)現(xiàn)。本研究為我國大氣污染與人體健康關(guān)系的研究提供了一定的毒性致炎機(jī)制的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：

生光后 TBST 洗膜 10min。生液 30min 沒過 PVDF 膜即可。膜 3 次，每次 10min，即可繼續(xù)用封閉液孵育。2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析處理細(xì)胞后的 MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 比色法，檢測(cè)不同濃度的 PM2.5 對(duì) Beas-2B 細(xì)胞的 2-1 所示，同空白組相比 PM2.5 處理后的劑量組，隨存活率呈明顯下降并且存在劑量依賴關(guān)系。結(jié)果表支氣管上皮細(xì)胞 Beas-2B 的生長(zhǎng)，存在濃度依賴性。L 分別作為低、中、高濃度組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖 2- 2 PM2.5 對(duì) Beas-2B 細(xì)胞形態(tài)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果.5 處理后細(xì)胞內(nèi) NO 水平變化情況炎癥反應(yīng)進(jìn)程每一個(gè)階段都有產(chǎn)生，，其參與多種炎癥信號(hào)相互作用。DAF-FM 本身有弱熒光，NO 與其反應(yīng)后產(chǎn)生，空白組僅有本身探針的微弱熒光，隨著 PM2.5 藥物濃度增強(qiáng)并且有強(qiáng)烈熒光的細(xì)胞數(shù)目明顯增加，以劑量依賴方 水平隨著藥物濃度的變化，表明 PM2.5 刺激 Beas-2B 細(xì)胞氧化應(yīng)激程度也隨著增強(qiáng)。
【學(xué)位授予單位】：遼寧大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R122

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2687396