【摘要】：鉛離子具有毒性大、易生物富集、不可生物降解等特點(diǎn),是一種廣泛存在于環(huán)境中的重金屬離子,也是常見(jiàn)的環(huán)境污染物。人體可以通過(guò)飲食攝入環(huán)境中的鉛,富集至一定含量后易導(dǎo)致鉛中毒,威脅生命健康。傳統(tǒng)的儀器分析方法具有設(shè)備成本高、樣品前處理復(fù)雜等缺點(diǎn),因此構(gòu)建操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、成本低的Pb~(2+)檢測(cè)分析方法具有重要意義。以功能核酸為識(shí)別單元的生物傳感器由于高靈敏度和特異性在分析檢測(cè)領(lǐng)域受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注。熒光分析方法具有高靈敏度、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、生物成像、分子診斷等領(lǐng)域。核酸熒光探針是以具有特異性結(jié)合靶標(biāo)物質(zhì)的功能核酸為識(shí)別單元、可發(fā)射熒光的熒光材料為信號(hào)單元構(gòu)建的探針。本文利用共軛芴具有穩(wěn)定的發(fā)光性能、高量子產(chǎn)率等優(yōu)點(diǎn),以可發(fā)射熒光的熒光材料共軛芴衍生物(CF)為信號(hào)單元,設(shè)計(jì)構(gòu)建了單標(biāo)記的熒光核酸探針CF-DNA,簡(jiǎn)化了核酸探針的設(shè)計(jì)合成步驟,避免了復(fù)雜標(biāo)記對(duì)核酸識(shí)別性能的影響,實(shí)現(xiàn)了Pb~(2+)的高靈敏度和高選擇性檢測(cè),體現(xiàn)出較顯著的創(chuàng)新性,并取得了以下的研究成果:(1)以小分子芴為原料,先合成2,7-雙(4-苯甲酸甲酯)-9,9-二己基芴(CF_1),經(jīng)水解后得到2,7-雙(4-苯甲酸)-9,9-二己基芴(CF_2),然后與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)制得2,7-雙(4-苯甲酸)-9,9-二己基芴活性酯(CF),FT-IR和~1H-NMR表明,其結(jié)構(gòu)與預(yù)期設(shè)計(jì)相符。將2,7-雙(4-苯甲酸)-9,9-二己基芴活性酯(CF)與氨基修飾的富G序列Pb~(2+)-DNA反應(yīng),經(jīng)HPLC純化分離后得到設(shè)計(jì)構(gòu)建的CF-DNA探針。CF-DNA探針在260 nm和340 nm有明顯的紫外吸收峰,分子量為5497.4,與理論設(shè)計(jì)值相符,熒光激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm,熒光發(fā)射波長(zhǎng)為415 nm。(2)在CF-DNA核酸探針溶液中加入Pb~(2+)后,圓二色譜中260 nm處正峰和240nm處負(fù)峰的信號(hào)明顯增強(qiáng),溶液中膠粒的平均粒徑由1254 nm減小到1003 nm,表明核酸分子從無(wú)序狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槠叫行虶-四鏈體結(jié)構(gòu),CF-DNA探針與Pb~(2+)有較好的特異性結(jié)合,Pb~(2+)的加入使CF-DNA探針在水溶液中聚集狀態(tài)發(fā)生變化。CF-DNA探針檢測(cè)Pb~(2+)的最優(yōu)條件是:CF-DNA探針濃度為100 nM,選用PBS緩沖溶液作為檢測(cè)的緩沖環(huán)境,CF-DNA探針與Pb~(2+)反應(yīng)時(shí)間為15 min,反應(yīng)溫度為30℃。(3)CF-DNA探針對(duì)Pb~(2+)檢測(cè)具有高靈敏度,檢測(cè)限為0.36 nM,并對(duì)Pb~(2+)檢測(cè)具有很好的選擇性,而且CF-DNA探針具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。采用加標(biāo)回收法在對(duì)實(shí)際水樣Pb~(2+)檢測(cè)中,Pb~(2+)的回收率在96.6%-106%之間,顯示出良好的檢測(cè)效果,對(duì)在實(shí)際環(huán)境中Pb~(2+)的檢測(cè)具有較好的應(yīng)用前景。(4)利用自制的CF-DNA探針和氧化石墨烯(GO)對(duì)單鏈DNA的強(qiáng)吸附作用和高效的熒光猝滅性能,設(shè)計(jì)構(gòu)建了CF-DNA/GO探針,其檢測(cè)Pb~(2+)的最優(yōu)條件是:CF-DNA探針濃度為150 nM,GO濃度為50?g/mL,CF-DNA/GO探針與Pb~(2+)反應(yīng)時(shí)間為30 min,反應(yīng)溫度為30℃。(5)CF-DNA/GO探針對(duì)Pb~(2+)檢測(cè)具有高靈敏度,檢測(cè)限為0.24 nM,對(duì)Pb~(2+)檢測(cè)具有很好的選擇性,而且CF-DNA/GO探針具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。采用加標(biāo)回收法在對(duì)實(shí)際水樣Pb~(2+)檢測(cè)中,Pb~(2+)的回收率在98.3%-102%之間,顯示出良好的檢測(cè)效果,對(duì)在實(shí)際環(huán)境中Pb~(2+)的檢測(cè)具有較好的應(yīng)用前景。
【圖文】：

1-1 基于 FAM 標(biāo)記熒光探針用于 AFB1 的檢測(cè)原理圖Schematic representation of FAM aptamer probe in detectFB1 時(shí)，F(xiàn)AM 熒光素標(biāo)記的核酸適體與含猝滅基團(tuán) T形成互補(bǔ)雙鏈 DNA，核酸適體的熒光被猝滅。當(dāng)體系1 結(jié)合形成復(fù)合物，核酸適體與互補(bǔ)鏈結(jié)合力減弱，熒熒光信號(hào)恢復(fù)，，從而實(shí)現(xiàn)對(duì) AFB1 的檢測(cè)。于其獨(dú)特的尺寸結(jié)構(gòu)，因而具有如表面效應(yīng)、量子尺寸的物理化學(xué)性質(zhì)[63]。研究者們將核酸適體與納米材料結(jié)標(biāo)物的檢測(cè)。Zhu 等[64]利用 GO 對(duì)單鏈 DNA 的吸附與O 熒光探針用于雙酚 A（BisphenolA，BPA）的檢測(cè)。發(fā)生了構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，使含 FAM 熒光團(tuán)的 DNA 從 GO FRET 效應(yīng)減弱，熒光信號(hào)增強(qiáng)，該熒光探針對(duì) BPA 的

分子信標(biāo)構(gòu)建的熒光探針是帶負(fù)電荷的親水性生物大分子，能夠在細(xì)活細(xì)胞體系中檢測(cè)靶標(biāo)分子，實(shí)現(xiàn)在分子水平上對(duì)生物體內(nèi)活性物質(zhì)監(jiān)測(cè)，為腫瘤診斷與生物醫(yī)學(xué)提供了新的思路與平臺(tái)。如圖 1-2，Q結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了功能核酸探針用于原位成像以及細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性檢測(cè)。由端粒酶引物（TSP）短序列與 3’端巰基標(biāo)記構(gòu)成莖部和較長(zhǎng)序列子與分子信標(biāo)通過(guò) 3’端巰基結(jié)合，因而 5’端的熒光 Cy5 熒光基團(tuán)與RET 而致使熒光猝滅。在端粒酶的作用下，引發(fā) MB 的 TSP 片段擴(kuò)增，探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)，熒光點(diǎn)亮。通過(guò)探針與活細(xì)胞孵育，可在細(xì)號(hào)檢測(cè)。通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)端粒酶活性對(duì)在不同劑量端粒酶藥物作用下的檢測(cè)細(xì)胞端粒酶含量，由此區(qū)分正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞。Qian 等[71]還利子信標(biāo)結(jié)合，在 miRNA 與 MB 特異性結(jié)合后打開(kāi)信標(biāo)，熒光信號(hào)增以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi) miRNA 的高靈敏度檢測(cè)與胞內(nèi)原位成像，還可以在行光熱治療，破壞癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)癌癥靶向治療。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：X832;O657.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2630560