【摘要】：鉛離子具有毒性大、易生物富集、不可生物降解等特點,是一種廣泛存在于環(huán)境中的重金屬離子,也是常見的環(huán)境污染物。人體可以通過飲食攝入環(huán)境中的鉛,富集至一定含量后易導致鉛中毒,威脅生命健康。傳統(tǒng)的儀器分析方法具有設備成本高、樣品前處理復雜等缺點,因此構(gòu)建操作簡便、靈敏度高、成本低的Pb~(2+)檢測分析方法具有重要意義。以功能核酸為識別單元的生物傳感器由于高靈敏度和特異性在分析檢測領域受到越來越多研究者的關(guān)注。熒光分析方法具有高靈敏度、重現(xiàn)性好等優(yōu)點,廣泛應用于環(huán)境監(jiān)測、生物成像、分子診斷等領域。核酸熒光探針是以具有特異性結(jié)合靶標物質(zhì)的功能核酸為識別單元、可發(fā)射熒光的熒光材料為信號單元構(gòu)建的探針。本文利用共軛芴具有穩(wěn)定的發(fā)光性能、高量子產(chǎn)率等優(yōu)點,以可發(fā)射熒光的熒光材料共軛芴衍生物(CF)為信號單元,設計構(gòu)建了單標記的熒光核酸探針CF-DNA,簡化了核酸探針的設計合成步驟,避免了復雜標記對核酸識別性能的影響,實現(xiàn)了Pb~(2+)的高靈敏度和高選擇性檢測,體現(xiàn)出較顯著的創(chuàng)新性,并取得了以下的研究成果:(1)以小分子芴為原料,先合成2,7-雙(4-苯甲酸甲酯)-9,9-二己基芴(CF_1),經(jīng)水解后得到2,7-雙(4-苯甲酸)-9,9-二己基芴(CF_2),然后與N-羥基琥珀酰亞胺反應制得2,7-雙(4-苯甲酸)-9,9-二己基芴活性酯(CF),FT-IR和~1H-NMR表明,其結(jié)構(gòu)與預期設計相符。將2,7-雙(4-苯甲酸)-9,9-二己基芴活性酯(CF)與氨基修飾的富G序列Pb~(2+)-DNA反應,經(jīng)HPLC純化分離后得到設計構(gòu)建的CF-DNA探針。CF-DNA探針在260 nm和340 nm有明顯的紫外吸收峰,分子量為5497.4,與理論設計值相符,熒光激發(fā)波長為340 nm,熒光發(fā)射波長為415 nm。(2)在CF-DNA核酸探針溶液中加入Pb~(2+)后,圓二色譜中260 nm處正峰和240nm處負峰的信號明顯增強,溶液中膠粒的平均粒徑由1254 nm減小到1003 nm,表明核酸分子從無序狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槠叫行虶-四鏈體結(jié)構(gòu),CF-DNA探針與Pb~(2+)有較好的特異性結(jié)合,Pb~(2+)的加入使CF-DNA探針在水溶液中聚集狀態(tài)發(fā)生變化。CF-DNA探針檢測Pb~(2+)的最優(yōu)條件是:CF-DNA探針濃度為100 nM,選用PBS緩沖溶液作為檢測的緩沖環(huán)境,CF-DNA探針與Pb~(2+)反應時間為15 min,反應溫度為30℃。(3)CF-DNA探針對Pb~(2+)檢測具有高靈敏度,檢測限為0.36 nM,并對Pb~(2+)檢測具有很好的選擇性,而且CF-DNA探針具有較好的重復性和穩(wěn)定性。采用加標回收法在對實際水樣Pb~(2+)檢測中,Pb~(2+)的回收率在96.6%-106%之間,顯示出良好的檢測效果,對在實際環(huán)境中Pb~(2+)的檢測具有較好的應用前景。(4)利用自制的CF-DNA探針和氧化石墨烯(GO)對單鏈DNA的強吸附作用和高效的熒光猝滅性能,設計構(gòu)建了CF-DNA/GO探針,其檢測Pb~(2+)的最優(yōu)條件是:CF-DNA探針濃度為150 nM,GO濃度為50?g/mL,CF-DNA/GO探針與Pb~(2+)反應時間為30 min,反應溫度為30℃。(5)CF-DNA/GO探針對Pb~(2+)檢測具有高靈敏度,檢測限為0.24 nM,對Pb~(2+)檢測具有很好的選擇性,而且CF-DNA/GO探針具有較好的重復性和穩(wěn)定性。采用加標回收法在對實際水樣Pb~(2+)檢測中,Pb~(2+)的回收率在98.3%-102%之間,顯示出良好的檢測效果,對在實際環(huán)境中Pb~(2+)的檢測具有較好的應用前景。
【圖文】：

1-1 基于 FAM 標記熒光探針用于 AFB1 的檢測原理圖Schematic representation of FAM aptamer probe in detectFB1 時，F(xiàn)AM 熒光素標記的核酸適體與含猝滅基團 T形成互補雙鏈 DNA，核酸適體的熒光被猝滅。當體系1 結(jié)合形成復合物，核酸適體與互補鏈結(jié)合力減弱，熒熒光信號恢復，，從而實現(xiàn)對 AFB1 的檢測。于其獨特的尺寸結(jié)構(gòu)，因而具有如表面效應、量子尺寸的物理化學性質(zhì)[63]。研究者們將核酸適體與納米材料結(jié)標物的檢測。Zhu 等[64]利用 GO 對單鏈 DNA 的吸附與O 熒光探針用于雙酚 A（BisphenolA，BPA）的檢測。發(fā)生了構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，使含 FAM 熒光團的 DNA 從 GO FRET 效應減弱，熒光信號增強，該熒光探針對 BPA 的

分子信標構(gòu)建的熒光探針是帶負電荷的親水性生物大分子，能夠在細活細胞體系中檢測靶標分子，實現(xiàn)在分子水平上對生物體內(nèi)活性物質(zhì)監(jiān)測，為腫瘤診斷與生物醫(yī)學提供了新的思路與平臺。如圖 1-2，Q結(jié)構(gòu)設計了功能核酸探針用于原位成像以及細胞內(nèi)端粒酶活性檢測。由端粒酶引物（TSP）短序列與 3’端巰基標記構(gòu)成莖部和較長序列子與分子信標通過 3’端巰基結(jié)合，因而 5’端的熒光 Cy5 熒光基團與RET 而致使熒光猝滅。在端粒酶的作用下，引發(fā) MB 的 TSP 片段擴增，探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，熒光點亮。通過探針與活細胞孵育，可在細號檢測。通過動態(tài)監(jiān)測端粒酶活性對在不同劑量端粒酶藥物作用下的檢測細胞端粒酶含量，由此區(qū)分正常細胞與腫瘤細胞。Qian 等[71]還利子信標結(jié)合，在 miRNA 與 MB 特異性結(jié)合后打開信標，熒光信號增以實現(xiàn)對細胞內(nèi) miRNA 的高靈敏度檢測與胞內(nèi)原位成像，還可以在行光熱治療，破壞癌細胞，實現(xiàn)癌癥靶向治療。
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：X832;O657.3

【參考文獻】

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本文編號：2630560