【摘要】：秸稈資源是世界上豐富的、可再生的生物質(zhì)資源,其中富含碳、氮、磷、鉀及礦物質(zhì)元素,對(duì)改善土壤耕作性、增加有機(jī)質(zhì)含量具有重要意義。但秸稈具有由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等相互纏繞形成的致密結(jié)構(gòu),不易被降解利用。環(huán)保、有效的生物降解方法近年來(lái)備受關(guān)注,微生物分泌纖維素酶、半纖維素酶及木質(zhì)素酶能有效降解秸稈中的主要成分,對(duì)提高秸稈的綜合利用率發(fā)揮著重要的作用。本研究從鹽堿土壤中分離篩選得到3株秸稈降解細(xì)菌,并對(duì)其秸稈降解發(fā)酵條件、秸稈降解能力、酶活特性及關(guān)鍵酶基因進(jìn)行克隆及功能分析,具體研究結(jié)果如下:1.通過(guò)對(duì)6種土樣中內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶(BG)、木聚糖酶(xylanase)、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(LiP)、錳過(guò)氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)的酶活比較分析,從各酶活較高的鹽堿土、松樹(shù)土、楊樹(shù)土中分離篩選出3株秸稈降解菌yj1,yj2,yj3,經(jīng)革蘭氏染色及16SrDNA鑒定分別確定為假單胞菌屬(G㧟)、芽孢桿菌屬(G㧏)、短桿菌屬(G㧏)。3株菌降解秸稈的最適培養(yǎng)溫度及最適初始pH值分別為37℃、8;30℃、8;37℃、7。培養(yǎng)8天時(shí)秸稈降解率分別為:25.58%、26.61%、23.71%,且發(fā)酵液pH一直保持在8左右。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)獲得的3種秸稈降解菌具有一定的耐堿性,對(duì)玉米秸稈具有較強(qiáng)的降解能力,其中秸稈降解菌yj2的降解能力最強(qiáng)。2.秸稈降解需要多種纖維素降解酶共同參與。以CMCNa為碳源時(shí),yj2的EG、BG及xylanase酶活最高值分別為37.34U、266.89U、516.08U,而yj1、yj3無(wú)xylanase酶活,且EG、BG酶活僅為2.34U、2.23U。以秸稈為碳源時(shí),yj2的EG、BG、xylanase、LiP、MnP、Lac的酶活相較于yj1、yj3均較高,6種酶共同作用降解秸稈,而yj1、yj3沒(méi)有xylanase,主要依靠LiP、MnP、Lac降解秸稈。因此推斷菌株yj2降解效果好主要由xylanase發(fā)揮作用。3.以CMCNa、秸稈為碳源的條件下,菌株yj2的EG、BG、xylanase三個(gè)基因表達(dá)量均表現(xiàn)為24h高于12h,EG、BG、xylanase基因表達(dá)量與酶活變化趨勢(shì)一致。4.對(duì)3株菌的酶活分析可知,xylanase對(duì)秸稈降解具有重要作用,克隆得到該基因,命名為xylanase,大小為642bp,與NCBI提交木聚糖酶基因序列相似度均達(dá)95%以上。通過(guò)生物信息學(xué)分析表明,克隆得到的木聚糖酶屬于糖基水解酶家族11(GH11),是一種帶信號(hào)肽的、親水的堿性胞外分泌蛋白。將xylanase基因與表達(dá)載體pET-30a連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)其融合蛋白大小為28 KDa。利用DNS法測(cè)定木聚糖酶酶活,BL21(pET-30a-xylanase)菌株xylanase酶活24 h內(nèi)隨時(shí)間的增加而增加,在24 h時(shí)酶活達(dá)到最大為387.26U,酶活的變化呈顯著性差異。本研究還克隆得到內(nèi)切葡聚糖酶基因,命名為EG,大小為1500bp。通過(guò)生物信息學(xué)分析可知屬于糖基水解酶家族5(GH5),同時(shí)還含有碳水化合物結(jié)合域3(CBM3),同樣為帶信號(hào)肽的、親水的堿性胞外分泌蛋白。
【圖文】：

纖維素結(jié)構(gòu)維素(cellulose)是由多個(gè)葡萄糖以 β-1,4-糖苷鍵連接組成的大分子多（C6H10O5）n，分子量約為 2.4×106，n 為聚合度，代表纖維素分子素的理化性質(zhì)密切相關(guān)，不同類(lèi)型的纖維素具有不同的聚合度：50上不等[12-13]。Lynd 等[14]研究表明，纖維二糖是纖維素的基本結(jié)構(gòu)單基環(huán)含有 C2、C3、C6 位的碳原子上存在三個(gè)游離羥基位，與其他在分子間作用力及氫鍵作用下，使纖維素分子鏈形成原纖絲，原纖絲成更大的結(jié)晶性原纖維結(jié)構(gòu)。玉米秸稈細(xì)胞壁中富含有纖維素，并與間共價(jià)連接，木質(zhì)素和果膠等物質(zhì)作為粘合劑更增強(qiáng)植物體的機(jī)械這種復(fù)雜且緊密的空間使玉米秸稈中的纖維素具有難溶性、難降解低了傳統(tǒng)物理法、化學(xué)法處理對(duì)秸稈的降解效果。

酶轉(zhuǎn)化為葡萄糖[66]。通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析可知，木聚糖酶和纖維素酶均屬于糖苷水解酶家族成員，并且均通過(guò)催化斷裂 β-1,4-糖苷鍵實(shí)現(xiàn)的降解反應(yīng)。催化反應(yīng)主要由糖苷水解酶的兩個(gè)氨基酸殘基完成的，其中一個(gè)充當(dāng)質(zhì)子供體，另一個(gè)為親核基團(tuán)，機(jī)制可分為保留和反轉(zhuǎn)兩類(lèi)[67]。1.4.2 復(fù)合式纖維素酶系統(tǒng)上述多種降解木質(zhì)素的酶可能獨(dú)立存在，也可能形成包含高效水解酶的一種蛋白質(zhì)復(fù)合物或者有機(jī)體—纖維小體（cellulosome）[68]。Edward Bayer 等[69]于1983 年首次發(fā)現(xiàn)并提出此概念，隨后在厭氧細(xì)菌和真菌中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)纖維小體。纖維小體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，，體積龐大，包含一個(gè)無(wú)催化結(jié)構(gòu)的絞手蛋白（CipA），CipA含有 9 個(gè)粘接蛋白，4 個(gè) X-組件和 CBMIII，共需要 22 個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，最終通過(guò)II 型粘接蛋白結(jié)構(gòu)域錨定在細(xì)胞壁上。由于纖維小體具有緊密的結(jié)構(gòu)，使多種酶能協(xié)同作用加強(qiáng)水解作用，促進(jìn)底物與產(chǎn)物有效傳遞，有利于宿主細(xì)胞高效地降解吸收纖維素[70-71]。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：X172

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 左旭;王紅彥;王亞靜;王磊;景麗;王道龍;;中國(guó)玉米秸稈資源量估算及其自然適宜性評(píng)價(jià)[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)資源與區(qū)劃;2015年06期

2 劉曉梅;鄒亞杰;胡清秀;楊小紅;沈德龍;;菌渣纖維素降解菌的篩選與鑒定[J];農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào);2015年07期

3 王曉娥;姚方杰;;真菌降解木質(zhì)纖維素酶系的研究進(jìn)展[J];北方園藝;2015年03期

4 王海濱;韓立榮;馮俊濤;張興;;高效纖維素降解菌的篩選及復(fù)合菌系的構(gòu)建[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2015年04期

5 苗璐;武慧;王晶;楊偉新;郝錫聯(lián);周曉馥;;昆蟲(chóng)抗菌肽的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及分析[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年08期

6 劉海艷;白龍;趙海波;楊明明;曹斌云;;纖維素酶高產(chǎn)菌的篩選鑒定及纖維素酶基因的克隆與表達(dá)[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2012年05期

7 鄭明霞;李來(lái)慶;鄭明月;王旭;馬海玲;王凱軍;;堿處理對(duì)玉米秸稈纖維素結(jié)構(gòu)的影響[J];環(huán)境科學(xué)與技術(shù);2012年06期

8 吳鴻欣;曹洪國(guó);韓增德;王高斌;嚴(yán)杏玲;;中國(guó)玉米秸稈綜合利用技術(shù)介紹與探討[J];農(nóng)業(yè)工程;2011年03期

9 賀丹艷;羅永發(fā);;木聚糖酶生產(chǎn)工藝研究進(jìn)展及性能優(yōu)化[J];飼料工業(yè);2011年04期

10 王洪媛;范丙全;;三株高效秸稈纖維素降解真菌的篩選及其降解效果[J];微生物學(xué)報(bào);2010年07期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 李碩;秸稈還田與減量施氮對(duì)土壤固碳、培肥和農(nóng)田可持續(xù)生產(chǎn)的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2017年

2 黃丹蓮;堆肥微生物群落演替及木質(zhì)素降解功能微生物強(qiáng)化堆肥機(jī)理研究[D];湖南大學(xué);2011年

3 鄭劉春;玉米秸稈及其纖維素的改性和吸附水體鎘離子的機(jī)理研究[D];華南理工大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 羅偉光;枯草芽孢桿菌源纖維素酶基因的克隆、表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)[D];河南科技大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2626721