【摘要】：隨著工業(yè)發(fā)展,全球鉛(Lead,Pb)污染成為了不容忽視的環(huán)境問題之一。鉛及其化合物會(huì)對大氣、土壤、水體以及動(dòng)植物造成污染。研究表明,植物在逆境脅迫下為了維持細(xì)胞正常代謝或降低逆境對自身的危害,會(huì)調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)水平,進(jìn)而產(chǎn)生一系列復(fù)雜的表觀遺傳學(xué)變化,如基因組DNA甲基化修飾,來抵抗脅迫。目前尚不清楚植物在應(yīng)答鉛脅迫過程中,哪些基因DNA甲基化修飾發(fā)生變化,以及這些基因如何參與調(diào)控植物應(yīng)答鉛脅迫。本實(shí)驗(yàn)室前期利用DNA甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)(methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)分析鉛脅迫對本生煙草(Nicotiana benthamiana)基因組甲基化情況,克隆了多條與DNA甲基化調(diào)控相關(guān)的基因。本論文選定其中七條基因,分別為DNA-directed RNA polymerase subunit beta(NbDDRP)、EH domain-containing protein1(NbEF)、Homogentisate phytyltransferase(NbHPT)、NADH dehydrogenase(NbNADH)、Transmembrane protein(NbTM)、V-type proton ATPase subunit F(NbVAPF)、WRKY transcription factor(NbWRKY),通過Real-time PCR(qRT-PCR)、重亞硫酸鹽測序(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)技術(shù)、病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-induced Gene Silencing,VIGS)技術(shù)和亞細(xì)胞定位技術(shù),初步研究這些基因在植物響應(yīng)重金屬Pb~(2+)脅迫過程中的功能。主要結(jié)論如下:(1)不同濃度Pb~(2+)處理本生煙草15天后,分析本生煙草的甲基化酶(CMT3、MET1、DRM2)和去甲基化酶ROS1的表達(dá)量、候選基因表達(dá)量的變化情況,可知Pb~(2+)脅迫能夠誘導(dǎo)本生煙草中甲基化酶、去甲基化酶和7條候選基因表達(dá)水平改變。(2)不同濃度Pb~(2+)處理本生煙草引起候選基因所選區(qū)域DNA甲基化水平發(fā)生變化。(3)候選基因VIGS植物長勢明顯不如pYY13對照植物,有的甚至出現(xiàn)枯死。測定其中存活的基因?qū)?yīng)植株葉綠素含量,發(fā)現(xiàn)NbHPT VIGS植物的葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量均降低;NbTM VIGS植物的葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量均增加,經(jīng)800 mg·L~(-1) Pb~(2+)處理11天后,VIGS植物與對照植物比較,出現(xiàn)生長抑制,甚至枯死,分別取VIGS植物根、莖、葉,測定Pb~(2+)含量,發(fā)現(xiàn)與對照植物相比,NbHPT和NbWRKY VIGS植物根部Pb~(2+)含量明顯減少,NbTM VIGS變化不明顯;NbHPT VIGS植物莖內(nèi)所含Pb~(2+)明顯高于對照,NbWRKY VIGS則明顯低于對照,NbTM VIGS變化不明顯;對葉片Pb~(2+)含量測定結(jié)果可知,NbHPT、NbWRKY VIGS植物葉片中Pb~(2+)含量明顯增加,而NbTM VIGS植物與對照相比差異不明顯,說明候選基因沉默后其表達(dá)量下調(diào),導(dǎo)致對應(yīng)植物生長發(fā)育受到影響,葉綠素含量發(fā)生變化,對Pb~(2+)的耐受能力減弱,Pb~(2+)吸收紊亂。(4)亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示:NbDDRP定位在葉綠體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中;NbEF、NbNADH定位于細(xì)胞核。NbVAPF沒有觀察到熒光信號,推測其可能定位于液泡,液泡中pH偏低,影響GFP發(fā)光。
【圖文】：

本實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線圖

2.3 結(jié)果分析DNA 甲基化通過對基因組 DNA 的修飾，對生物遺傳信息進(jìn)行調(diào)節(jié)觀遺傳學(xué)方面入手。其重要作用表現(xiàn)在基因表達(dá)調(diào)控、發(fā)育調(diào)節(jié)、基因面。DNA 甲基化的特定狀態(tài)是通過從頭甲基化，，維持甲基化和活性去甲調(diào)節(jié)的結(jié)果，這個(gè)過程調(diào)節(jié)的酶是不同的。CMT3、MET1 和 DRM2 是的三種甲基化酶，ROS1 是去甲基化酶。重金屬 Pb2+處理后會(huì)影響這幾響其甲基化狀態(tài)。0、400、800 mg·L-1Pb2+處理本生煙草后，將其 RN進(jìn)行半定量 RT- PCR 和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析其表達(dá)量變化情況。2.3.1 甲基化酶 CMT3 表達(dá)量變化情況通過圖 2.1 的結(jié)果可以看出：重金屬 Pb2+處理后，NbCMT3表達(dá)量上調(diào)，mg·L-1上調(diào)程度高于 800 mg·L-1。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：X173;Q943.2;S572

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本文編號：2611714